DAPI

Le DAPI (prononcé « DAPPY », /ˈdæpiː/), ou 4′,6-diamidino-2-phénylindole , est un colorant fluorescent qui se lie fortement aux régions riches en adénine - thymine de l'ADN . Il est largement utilisé en microscopie à fluorescence . Comme le DAPI peut traverser une membrane cellulaire intacte , il peut être utilisé pour colorer les cellules vivantes et fixées , bien qu'il traverse la membrane moins efficacement dans les cellules vivantes et fournisse donc un marqueur de la viabilité de la membrane.

Le DAPI a été synthétisé pour la première fois en 1971 dans le laboratoire d'Otto Dann dans le cadre d'une recherche de médicaments pour traiter la trypanosomiase . Bien qu'il n'ait pas été efficace en tant que médicament, des recherches plus poussées ont montré qu'il se liait fortement à l'ADN et devenait plus fluorescent lorsqu'il se liait. Cela a conduit à son utilisation pour identifier l'ADN mitochondrial par ultracentrifugation en 1975, la première utilisation enregistrée du DAPI comme colorant fluorescent de l'ADN.

La forte fluorescence lorsqu'il est lié à l'ADN a conduit à l'adoption rapide du DAPI pour la coloration fluorescente de l'ADN en microscopie à fluorescence . Son utilisation pour la détection de l'ADN dans les cellules végétales , métazoaires et bactériennes et dans les particules virales a été démontrée à la fin des années 1970, et la coloration quantitative de l'ADN à l'intérieur des cellules a été démontrée en 1977. L'utilisation du DAPI comme colorant de l'ADN pour la cytométrie de flux a également été démontrée à cette époque.

Lorsqu'il est lié à l'ADN double brin, le DAPI présente un maximum d'absorption à une longueur d'onde de 358 nm ( ultraviolet ) et son maximum d'émission est à 461 nm (bleu). Par conséquent, pour la microscopie à fluorescence, le DAPI est excité par la lumière ultraviolette et est détecté à travers un filtre bleu/cyan. Le pic d'émission est assez large. Le DAPI se lie également à l'ARN , bien qu'il ne soit pas aussi fortement fluorescent. Son émission se déplace vers 500 nm lorsqu'il est lié à l'ARN.

L'émission bleue du DAPI est pratique pour les microscopistes qui souhaitent utiliser plusieurs colorants fluorescents dans un seul échantillon. Il existe un certain chevauchement de fluorescence entre le DAPI et les molécules fluorescentes vertes comme la fluorescéine et la protéine fluorescente verte (GFP), mais l'effet de ce chevauchement est faible. L'utilisation du démixage spectral peut prendre en compte cet effet si une analyse d'image extrêmement précise est requise.

En dehors de la microscopie à fluorescence analytique, le DAPI est également populaire pour le marquage des cultures cellulaires afin de détecter l'ADN de mycoplasmes ou de virus contaminants . Les particules de mycoplasmes ou de virus marquées dans le milieu de croissance deviennent fluorescentes une fois colorées par le DAPI, ce qui les rend faciles à détecter.

Cette sonde fluorescente d'ADN a été efficacement modélisée en utilisant la théorie de la fonctionnelle de la densité dépendante du temps , couplée à la version IEF du modèle de continuum polarisable . Cette modélisation quantique-mécanique a rationalisé le comportement d'absorption et de fluorescence donné par la liaison et l'intercalation des sillons mineurs dans la poche d'ADN, en termes de flexibilité structurelle et de polarisation réduites.

Le DAPI peut être utilisé pour la coloration des cellules fixées. La concentration de DAPI nécessaire pour la coloration des cellules vivantes est généralement très élevée ; il est rarement utilisé pour les cellules vivantes. Il est étiqueté comme non toxique dans sa fiche signalétique et bien qu'il n'ait pas été démontré qu'il avait une mutagénicité pour E. coli , il est étiqueté comme un mutagène connu dans les informations du fabricant. Comme il s'agit d'un petit composé de liaison à l'ADN, il est susceptible d'avoir des effets cancérigènes et des précautions doivent être prises lors de sa manipulation et de son élimination.

Les colorations Hoechst sont similaires au DAPI dans la mesure où ce sont également des colorations d'ADN fluorescentes bleues qui sont compatibles avec les applications sur cellules vivantes et fixées, ainsi que visibles en utilisant les mêmes paramètres de filtre d'équipement que pour le DAPI.