Différenciation dirigée

La différenciation dirigée est une méthodologie de bio-ingénierie à l'interface de la biologie des cellules souches , de la biologie du développement et de l'ingénierie tissulaire . Elle consiste essentiellement à exploiter le potentiel des cellules souches en limitant leur différenciation in vitro vers un type de cellule ou un tissu d'intérêt spécifique. Les cellules souches sont par définition pluripotentes , capables de se différencier en plusieurs types de cellules tels que les neurones , les cardiomyocytes , les hépatocytes , etc. Une différenciation dirigée efficace nécessite une compréhension détaillée de la lignée et de la décision sur le destin cellulaire , souvent fournie par la biologie du développement.

Au cours de la différenciation, les cellules pluripotentes prennent un certain nombre de décisions développementales pour générer d'abord les trois feuillets germinaux ( ectoderme , mésoderme et endoderme ) de l'embryon et des progéniteurs intermédiaires, suivis de décisions ultérieures ou de points de contrôle, donnant naissance à tous les tissus matures du corps. Le processus de différenciation peut être modélisé comme une séquence de décisions binaires basées sur des modèles probabilistes ou stochastiques . La biologie du développement et l'embryologie fournissent les connaissances de base sur la différenciation des types cellulaires grâce à l'analyse des mutations , au traçage de la lignée, à la micromanipulation de l'embryon et aux études d'expression génétique . La différenciation cellulaire et l'organogenèse tissulaire impliquent un ensemble limité de voies de signalisation développementales . Il est ainsi possible de diriger le destin cellulaire en contrôlant les décisions cellulaires par le biais d'une signalisation extracellulaire, imitant les signaux de développement.

La différenciation dirigée est principalement appliquée aux cellules souches pluripotentes (PSC) d'origine mammifère, en particulier aux cellules de souris et humaines pour des applications de recherche biomédicale . Depuis la découverte des cellules souches embryonnaires (ES) (1981) et des cellules souches pluripotentes induites (iPS) (2006), le matériel source est potentiellement illimité. Historiquement, les cellules du carcinome embryonnaire (EC) ont également été utilisées. Les fibroblastes ou d'autres types de cellules différenciées ont été utilisés pour des stratégies de reprogrammation directe .

La différenciation cellulaire implique une transition d'un mode prolifératif vers un mode de différenciation. La différenciation dirigée consiste à imiter les décisions de développement (développement de l'embryon) in vitro en utilisant les cellules souches comme matériau source. À cette fin, les cellules souches pluripotentes (PSC) sont cultivées dans des conditions contrôlées impliquant un substrat spécifique ou des matrices extracellulaires favorisant l'adhésion et la différenciation cellulaires, et définissent des compositions de milieux de culture . Un nombre limité de facteurs de signalisation tels que des facteurs de croissance ou des petites molécules , contrôlant la différenciation cellulaire, est appliqué de manière séquentielle ou combinatoire, à des doses et des temps d'exposition variables. La différenciation appropriée du type de cellule d'intérêt est vérifiée en analysant des marqueurs spécifiques du type de cellule , le profil d'expression génétique et des tests fonctionnels.

• co-culture avec des cellules stromales ou des cellules nourricières , et sur des substrats de culture spécifiques :

les cellules et les matrices de soutien fournissent des signaux environnementaux de type développemental.

• Formation d'agrégats cellulaires 3D, appelés corps embryonnaires (EB) : l'agrégat vise à imiter le développement embryonnaire précoce et à instruire la différenciation cellulaire.
• culture en présence de sérum bovin foetal , élimination des facteurs de pluripotence.

Cette méthode consiste à exposer les cellules à des modulateurs spécifiques de voies de signalisation et à manipuler les conditions de culture cellulaire (environnementales ou exogènes) pour imiter la séquence naturelle des décisions de développement pour produire un type de cellule/tissu donné. Un inconvénient de cette approche est la nécessité d'avoir une bonne compréhension de la façon dont le type de cellule d'intérêt est formé.

Cette méthode, également appelée transdifférenciation ou conversion directe, consiste à surexprimer un ou plusieurs facteurs, généralement des facteurs de transcription, introduits dans les cellules. Le matériel de départ peut être soit des cellules souches pluripotentes (CSP), soit des cellules différenciées comme les fibroblastes. Le principe a été démontré pour la première fois en 1987 avec les facteurs myogéniques MyoD. Un inconvénient de cette approche est l'introduction d'acide nucléique étranger dans les cellules et l'expression forcée de facteurs de transcription dont les effets ne sont pas entièrement compris.

Cette méthode consiste à sélectionner le type cellulaire d'intérêt, généralement résistant aux antibiotiques . Pour cela, les cellules sources sont modifiées pour contenir une cassette de résistance aux antibiotiques sous un promoteur spécifique du type cellulaire cible . Seules les cellules appartenant à la lignée d'intérêt survivent à la sélection .

La différenciation dirigée fournit une source potentiellement illimitée et manipulable de cellules et de tissus. Certaines applications sont entravées par le phénotype immature du type cellulaire dérivé des cellules souches pluripotentes (PSC), ce qui limite les études physiologiques et fonctionnelles possibles. Plusieurs domaines d'application ont émergé :

Pour les sciences fondamentales , notamment la biologie du développement et la biologie cellulaire , les cellules dérivées de PSC permettent d'étudier aux niveaux moléculaire et cellulaire des questions fondamentales in vitro, qui auraient été autrement extrêmement difficiles ou impossibles à étudier pour des raisons techniques et éthiques in vivo, comme le développement embryonnaire de l'homme. En particulier, les cellules en différenciation se prêtent à des études quantitatives et qualitatives. Des processus plus complexes peuvent également être étudiés in vitro et la formation d'organoïdes, notamment des cérébroïdes, de la cupule optique et du rein, a été décrite.

Les types de cellules différenciées des cellules souches pluripotentes (CSP) sont évalués comme modèles précliniques in vitro de maladies humaines. Les types de cellules humaines dans une boîte de Pétri offrent une alternative aux tests précliniques traditionnels utilisant des cellules animales, humaines immortalisées ou des cultures primaires issues de biopsies , qui ont leurs limites. Les types de cellules cliniquement pertinents, c'est-à-dire les types de cellules affectées par les maladies, sont un objectif majeur de recherche, notamment les hépatocytes , les cellules bêta des îlots de Langerhans , les cardiomyocytes et les neurones . Le criblage de médicaments est effectué sur une culture cellulaire miniaturisée dans des plaques multipuits ou sur une puce.

Les cellules dérivées de PSC provenant de patients sont utilisées in vitro pour recréer des pathologies spécifiques. Le type de cellule spécifique affecté dans la pathologie est à la base du modèle. Par exemple, les motoneurones sont utilisés pour étudier l'amyotrophie spinale (SMA) et les cardiomyocytes sont utilisés pour étudier l'arythmie . Cela peut permettre une meilleure compréhension de la pathogenèse et le développement de nouveaux traitements grâce à la découverte de médicaments. Les types de cellules immatures dérivées de PSC peuvent être maturées in vitro par diverses stratégies, telles que le vieillissement in vitro, pour modéliser in vitro les maladies liées à l'âge. Les principales maladies modélisées avec des cellules dérivées de PSC sont la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), le syndrome de l'X fragile (FXS), la maladie de Huntington (HD), le syndrome de Down , l'amyotrophie spinale (SMA), les dystrophies musculaires , la fibrose kystique , le syndrome du QT long et le diabète de type I.

La source potentiellement illimitée de cellules et de tissus peut avoir une application directe pour l'ingénierie tissulaire , le remplacement cellulaire et la transplantation après des blessures aiguës et une chirurgie reconstructive . Ces applications sont limitées aux types de cellules qui peuvent être différenciées efficacement et en toute sécurité à partir de cellules souches embryonnaires humaines avec une organogénèse appropriée . Les organes décellularisés sont également utilisés comme échafaudage tissulaire pour l'organogénèse. Le matériel source peut être des cellules saines normales provenant d'un autre donneur (transplantation hétérologue) ou génétiquement corrigées provenant du même patient (autologue). Des inquiétudes concernant la sécurité des patients ont été soulevées en raison de la possibilité de contamination des cellules indifférenciées. Le premier essai clinique utilisant des cellules dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) a eu lieu en 2011. Le premier essai clinique utilisant des cellules dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (hiPSC) a débuté en 2014 au Japon.