Vecteur d'expression

Un vecteur d'expression , également appelé construction d'expression , est généralement un plasmide ou un virus conçu pour l'expression génique dans les cellules. Le vecteur est utilisé pour introduire un gène spécifique dans une cellule cible et peut commander le mécanisme de synthèse protéique de la cellule pour produire la protéine codée par le gène. Les vecteurs d'expression sont les outils de base de la biotechnologie pour la production de protéines .

Le vecteur est conçu pour contenir des séquences régulatrices qui agissent comme des régions amplificatrices et promotrices et conduisent à une transcription efficace du gène porté par le vecteur d'expression. L'objectif d'un vecteur d'expression bien conçu est la production efficace de protéines, et cela peut être atteint par la production d'une quantité importante d' ARN messager stable , qui peut ensuite être traduit en protéine. L'expression d'une protéine peut être étroitement contrôlée, et la protéine n'est produite en quantité importante que lorsque cela est nécessaire grâce à l'utilisation d'un inducteur , dans certains systèmes cependant la protéine peut être exprimée de manière constitutive. Escherichia coli est couramment utilisé comme hôte pour la production de protéines , mais d'autres types de cellules peuvent également être utilisés. Un exemple d'utilisation du vecteur d'expression est la production d' insuline , qui est utilisée pour les traitements médicaux du diabète .

Un vecteur d'expression possède des caractéristiques que tout vecteur peut posséder, comme une origine de réplication , un marqueur sélectionnable et un site approprié pour l'insertion d'un gène comme le site de clonage multiple . Le gène cloné peut être transféré d'un vecteur de clonage spécialisé à un vecteur d'expression, bien qu'il soit possible de cloner directement dans un vecteur d'expression. Le processus de clonage est normalement effectué dans Escherichia coli . Les vecteurs utilisés pour la production de protéines dans des organismes autres que E. coli peuvent avoir, en plus d'une origine de réplication appropriée pour sa propagation dans E. coli , des éléments qui leur permettent d'être maintenus dans un autre organisme, et ces vecteurs sont appelés vecteurs navettes .

Un vecteur d'expression doit contenir les éléments nécessaires à l'expression des gènes. Il peut s'agir d'un promoteur , de la séquence d'initiation de la traduction correcte, comme un site de liaison ribosomique et un codon de départ , un codon de terminaison et une séquence de terminaison de la transcription . Il existe des différences dans la machinerie de synthèse des protéines entre les procaryotes et les eucaryotes, c'est pourquoi les vecteurs d'expression doivent contenir les éléments d'expression appropriés à l'hôte choisi. Par exemple, les vecteurs d'expression des procaryotes auraient une séquence Shine-Dalgarno à leur site d'initiation de la traduction pour la liaison des ribosomes, tandis que les vecteurs d'expression des eucaryotes contiendraient la séquence consensus Kozak .

Le promoteur initie la transcription et constitue donc le point de contrôle de l'expression du gène cloné. Les promoteurs utilisés dans le vecteur d'expression sont normalement inductibles , ce qui signifie que la synthèse protéique n'est initiée que lorsque cela est nécessaire par l'introduction d'un inducteur tel que l'IPTG . Cependant, l'expression génique peut également être constitutive (c'est-à-dire que la protéine est constamment exprimée) dans certains vecteurs d'expression. Un faible niveau de synthèse protéique constitutive peut se produire même dans les vecteurs d'expression avec des promoteurs étroitement contrôlés.

Après l'expression du produit génique, il peut être nécessaire de purifier la protéine exprimée ; cependant, séparer la protéine d'intérêt de la grande majorité des protéines de la cellule hôte peut être un processus long. Pour faciliter ce processus de purification, une étiquette de purification peut être ajoutée au gène cloné. Cette étiquette peut être une étiquette histidine (His) , d'autres peptides marqueurs ou des partenaires de fusion tels que la glutathion S-transférase ou la protéine de liaison au maltose . Certains de ces partenaires de fusion peuvent également aider à augmenter la solubilité de certaines protéines exprimées. D'autres protéines de fusion telles que la protéine fluorescente verte peuvent agir comme gène rapporteur pour l'identification de gènes clonés avec succès, ou elles peuvent être utilisées pour étudier l'expression des protéines en imagerie cellulaire .

Le vecteur d'expression est transformé ou transfecté dans la cellule hôte pour la synthèse protéique. Certains vecteurs d'expression peuvent comporter des éléments permettant la transformation ou l'insertion d'ADN dans le chromosome de l'hôte, par exemple les gènes vir pour la transformation des plantes et les sites d'intégrase pour l'intégration chromosomique.

Certains vecteurs peuvent inclure une séquence de ciblage qui peut cibler la protéine exprimée vers un emplacement spécifique tel que l' espace périplasmique des bactéries.

Différents organismes peuvent être utilisés pour exprimer la protéine cible d'un gène, et le vecteur d'expression utilisé comportera donc des éléments spécifiques à l'organisme en question. L'organisme le plus couramment utilisé pour la production de protéines est la bactérie Escherichia coli . Cependant, toutes les protéines ne peuvent pas être exprimées avec succès dans E. coli , ou être exprimées avec la forme correcte de modifications post-traductionnelles telles que les glycosylations, et d'autres systèmes peuvent donc être utilisés.

L'hôte d'expression de choix pour l'expression de nombreuses protéines est Escherichia coli car la production de protéines hétérologues dans E. coli est relativement simple et pratique, en plus d'être rapide et peu coûteuse. Un grand nombre de plasmides d'expression d'E. coli sont également disponibles pour une grande variété de besoins. Parmi les autres bactéries utilisées pour la production de protéines, on trouve Bacillus subtilis .

La plupart des protéines hétérologues sont exprimées dans le cytoplasme d' E. coli . Cependant, toutes les protéines formées ne sont pas forcément solubles dans le cytoplasme, et les protéines mal repliées formées dans le cytoplasme peuvent former des agrégats insolubles appelés corps d'inclusion . Ces protéines insolubles nécessiteront un repliement, ce qui peut être un processus complexe et ne pas nécessairement produire un rendement élevé. Les protéines qui ont des liaisons disulfures ne sont souvent pas capables de se replier correctement en raison de l'environnement réducteur dans le cytoplasme qui empêche une telle formation de liaison, et une solution possible est de cibler la protéine vers l' espace périplasmique en utilisant une séquence signal N-terminale . Une autre possibilité est de manipuler l'environnement redox du cytoplasme. D'autres systèmes plus sophistiqués sont également en cours de développement ; de tels systèmes pourraient permettre l'expression de protéines auparavant considérées comme impossibles dans E. coli , telles que les protéines glycosylées .

Les promoteurs utilisés pour ces vecteurs sont généralement basés sur le promoteur de l' opéron lac ou sur le promoteur T7 , et ils sont normalement régulés par l' opérateur lac . Ces promoteurs peuvent également être des hybrides de différents promoteurs, par exemple, le promoteur Tac est un hybride de promoteurs trp et lac . lac ou dérivés de lac les plus couramment utilisés sont basés sur le mutant lac UV5 qui est insensible à la répression catabolique . Ce mutant permet l'expression de protéines sous le contrôle du promoteur lac lorsque le milieu de croissance contient du glucose puisque le glucose inhiberait l'expression génique si le promoteur lac de type sauvage était utilisé. La présence de glucose peut néanmoins toujours être utilisée pour réduire l'expression de fond par inhibition résiduelle dans certains systèmes.

Des exemples de vecteurs d'expression d'E. coli sont la série de vecteurs pGEX où la glutathion S-transférase est utilisée comme partenaire de fusion et l'expression génique est sous le contrôle du promoteur tac, et la série de vecteurs pET qui utilise un promoteur T7 .

Il est possible d'exprimer simultanément deux ou plusieurs protéines différentes dans E. coli en utilisant des plasmides différents. Cependant, lorsque deux ou plusieurs plasmides sont utilisés, chaque plasmide doit utiliser une sélection d'antibiotiques différente ainsi qu'une origine de réplication différente, sinon l'un des plasmides risque de ne pas être maintenu de manière stable. De nombreux plasmides couramment utilisés sont basés sur le réplicon ColE1 et sont donc incompatibles entre eux ; pour qu'un plasmide basé sur ColE1 puisse coexister avec un autre dans la même cellule, l'autre devrait être d'un réplicon différent, par exemple un plasmide basé sur le réplicon p15A tel que la série de plasmides pACYC. Une autre approche consisterait à utiliser un seul vecteur à deux cistrons ou à concevoir les séquences codantes en tandem sous forme de construction bi- ou poly-cistronique.

Une levure couramment utilisée pour la production de protéines est Pichia pastoris . Des exemples de vecteur d'expression de levure dans Pichia sont la série de vecteurs pPIC, et ces vecteurs utilisent le promoteur AOX1 qui est inductible avec du méthanol . Les plasmides peuvent contenir des éléments pour l'insertion d'ADN étranger dans le génome de la levure et une séquence signal pour la sécrétion de la protéine exprimée. Les protéines avec des liaisons disulfures et une glycosylation peuvent être produites efficacement dans la levure. Une autre levure utilisée pour la production de protéines est Kluyveromyces lactis et le gène est exprimé, entraîné par une variante du promoteur de la lactase forte LAC4.

Saccharomyces cerevisiae est particulièrement largement utilisé pour les études d'expression génique chez la levure, par exemple dans le système à double hybride de levure pour l'étude de l'interaction protéine-protéine. Les vecteurs utilisés dans le système à double hybride de levure contiennent des partenaires de fusion pour deux gènes clonés qui permettent la transcription d'un gène rapporteur lorsqu'il y a interaction entre les deux protéines exprimées à partir des gènes clonés.

Le baculovirus , un virus en forme de bâtonnet qui infecte les cellules d'insectes, est utilisé comme vecteur d'expression dans ce système. Des lignées cellulaires d'insectes dérivées de lépidoptères (mites et papillons), comme Spodoptera frugiperda , sont utilisées comme hôte. Une lignée cellulaire dérivée de la chenille arpenteuse du chou est particulièrement intéressante, car elle a été développée pour se développer rapidement et sans le sérum coûteux normalement nécessaire pour stimuler la croissance cellulaire. Le vecteur navette est appelé bacmide, et l'expression génique est sous le contrôle d'un promoteur puissant pPolh. Le baculovirus a également été utilisé avec des lignées cellulaires de mammifères dans le système BacMam .

Le baculovirus est généralement utilisé pour la production de glycoprotéines , bien que les glycosylations puissent être différentes de celles trouvées chez les vertébrés. En général, son utilisation est plus sûre que celle des virus de mammifères car il a une gamme d'hôtes limitée et n'infecte pas les vertébrés sans modifications.

De nombreux vecteurs d'expression végétale sont basés sur le plasmide Ti d' Agrobacterium tumefaciens . Dans ces vecteurs d'expression, l'ADN à insérer dans la plante est cloné dans l' ADN-T , un fragment d'ADN flanqué d'une séquence de répétition directe de 25 pb à chaque extrémité, et qui peut s'intégrer dans le génome de la plante. L'ADN-T contient également le marqueur sélectionnable. L' Agrobacterium fournit un mécanisme de transformation , d'intégration dans le génome de la plante, et les promoteurs de ses gènes vir peuvent également être utilisés pour les gènes clonés. Les inquiétudes concernant le transfert de matériel génétique bactérien ou viral dans la plante ont cependant conduit au développement de vecteurs appelés vecteurs intragéniques dans lesquels des équivalents fonctionnels du génome de la plante sont utilisés de sorte qu'il n'y a pas de transfert de matériel génétique d'une espèce étrangère dans la plante.

Les virus végétaux peuvent être utilisés comme vecteurs, car la méthode Agrobacterium ne fonctionne pas pour toutes les plantes. Parmi les exemples de virus végétaux utilisés, on peut citer le virus de la mosaïque du tabac (TMV), le virus X de la pomme de terre et le virus de la mosaïque du niébé . La protéine peut être exprimée sous forme de fusion avec la protéine de coque du virus et est affichée à la surface des particules virales assemblées, ou sous forme de protéine non fusionnée qui s'accumule dans la plante. L'expression dans la plante à l'aide de vecteurs végétaux est souvent constitutive, et un promoteur constitutif couramment utilisé dans les vecteurs d'expression végétale est le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV).

Les vecteurs d'expression mammaliens offrent des avantages considérables pour l'expression des protéines mammaliennes par rapport aux systèmes d'expression bactériens : repliement correct, modifications post-traductionnelles et activité enzymatique pertinente. Ils peuvent également être plus souhaitables que d'autres systèmes eucaryotes non mammaliens dans lesquels les protéines exprimées peuvent ne pas contenir les glycosylations correctes. Ils sont particulièrement utiles pour produire des protéines associées à la membrane qui nécessitent des chaperons pour un repliement et une stabilité corrects ainsi que pour contenir de nombreuses modifications post-traductionnelles. L'inconvénient, cependant, est le faible rendement du produit par rapport aux vecteurs procaryotes ainsi que la nature coûteuse des techniques impliquées. Sa technologie compliquée et la contamination potentielle par des virus animaux d'expression de cellules mammaliennes ont également limité son utilisation dans la production industrielle à grande échelle.

Des lignées cellulaires de mammifères cultivées telles que l' ovaire de hamster chinois (CHO) , COS , y compris des lignées cellulaires humaines telles que HEK et HeLa peuvent être utilisées pour produire des protéines. Les vecteurs sont transfectés dans les cellules et l'ADN peut être intégré dans le génome par recombinaison homologue dans le cas d'une transfection stable, ou les cellules peuvent être transfectées de manière transitoire. Des exemples de vecteurs d'expression de mammifères comprennent les vecteurs adénoviraux , les séries pSV et pCMV de vecteurs plasmidiques, les vecteurs de la vaccine et rétroviraux , ainsi que le baculovirus. Les promoteurs du cytomégalovirus (CMV) et du SV40 sont couramment utilisés dans les vecteurs d'expression de mammifères pour stimuler l'expression des gènes. Un promoteur non viral, tel que le promoteur du facteur d'élongation (EF)-1, est également connu.

Le lysat cellulaire d'E. coli contenant les composants cellulaires nécessaires à la transcription et à la traduction est utilisé dans cette méthode in vitro de production de protéines. L'avantage de ce système est que les protéines peuvent être produites beaucoup plus rapidement que celles produites in vivo car il ne nécessite pas de temps de culture des cellules, mais il est également plus coûteux. Les vecteurs utilisés pour l'expression d'E. coli peuvent être utilisés dans ce système, bien que des vecteurs spécifiquement conçus pour ce système soient également disponibles. Les extraits de cellules eucaryotes peuvent également être utilisés dans d'autres systèmes acellulaires, par exemple, les systèmes d'expression acellulaires de germe de blé . Des systèmes acellulaires de mammifères ont également été produits.

Le vecteur d'expression dans un hôte d'expression est désormais la méthode habituelle utilisée dans les laboratoires pour produire des protéines destinées à la recherche. La plupart des protéines sont produites dans E. coli , mais pour les protéines glycosylées et celles avec des liaisons disulfures, des systèmes de levure, de baculovirus et de mammifères peuvent être utilisés.

La plupart des produits pharmaceutiques à base de protéines sont désormais produits par la technologie de l'ADN recombinant à l'aide de vecteurs d'expression. Ces produits pharmaceutiques à base de peptides et de protéines peuvent être des hormones, des vaccins, des antibiotiques, des anticorps et des enzymes. La première protéine recombinante humaine utilisée pour la gestion des maladies, l'insuline, a été introduite en 1982. La biotechnologie permet de produire en grande quantité ces produits pharmaceutiques à base de peptides et de protéines, dont certains étaient auparavant rares ou difficiles à obtenir. Elle réduit également les risques de contamination tels que les virus hôtes, les toxines et les prions . Parmi les exemples du passé, citons la contamination par les prions de l'hormone de croissance extraite des glandes pituitaires prélevées sur des cadavres humains, qui a provoqué la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez des patients recevant un traitement pour le nanisme , et les contaminants viraux du facteur VIII de coagulation isolé du sang humain qui ont entraîné la transmission de maladies virales telles que l'hépatite et le SIDA . Ce risque est réduit ou complètement éliminé lorsque les protéines sont produites dans des cellules hôtes non humaines.

Ces dernières années, des vecteurs d'expression ont été utilisés pour introduire des gènes spécifiques dans des plantes et des animaux afin de produire des organismes transgéniques , par exemple en agriculture, ils sont utilisés pour produire des plantes transgéniques . Des vecteurs d'expression ont été utilisés pour introduire un précurseur de la vitamine A , le bêta-carotène , dans des plants de riz. Ce produit est appelé riz doré . Ce procédé a également été utilisé pour introduire un gène dans des plantes qui produit un insecticide , appelé toxine de Bacillus thuringiensis ou toxine Bt , qui réduit la nécessité pour les agriculteurs d'appliquer des insecticides puisqu'il est produit par l'organisme modifié. En outre, les vecteurs d'expression sont utilisés pour prolonger la maturité des tomates en modifiant la plante de sorte qu'elle produise moins de produit chimique qui provoque la pourriture des tomates. L'utilisation de vecteurs d'expression pour modifier les cultures a fait l'objet de controverses en raison du fait qu'il pourrait y avoir des risques sanitaires inconnus, des possibilités de brevetage par les entreprises de certaines cultures alimentaires génétiquement modifiées et des préoccupations éthiques. Néanmoins, cette technique est toujours utilisée et fait l'objet de recherches approfondies.

Des animaux transgéniques ont également été produits pour étudier les processus biochimiques des animaux et les maladies humaines, ou utilisés pour produire des produits pharmaceutiques et d'autres protéines. Ils peuvent également être modifiés pour avoir des caractéristiques avantageuses ou utiles. La protéine fluorescente verte est parfois utilisée comme marqueur, ce qui permet à l'animal de devenir fluorescent, et cela a été exploité commercialement pour produire le GloFish fluorescent .

La thérapie génique est un traitement prometteur pour un certain nombre de maladies dans lequel un gène « normal » porté par le vecteur est inséré dans le génome, pour remplacer un gène « anormal » ou compléter l'expression d'un gène particulier. Des vecteurs viraux sont généralement utilisés, mais d'autres méthodes non virales d'administration sont en cours de développement. Le traitement reste une option risquée en raison du vecteur viral utilisé qui peut provoquer des effets indésirables, par exemple en donnant lieu à une mutation insertionnelle pouvant entraîner un cancer. Cependant, des résultats prometteurs ont été obtenus.