Métatranscriptomique

Le microbiome est défini comme une communauté microbienne occupant un habitat bien défini . Ces communautés sont omniprésentes et jouent un rôle clé dans le maintien des caractéristiques de leur environnement. Un déséquilibre au sein de ces communautés peut affecter négativement le fonctionnement du milieu dans lequel elles résident. Différentes approches omiques ont été utilisées pour étudier ces communautés et déterminer leur impact et leur corrélation avec leur niche. Si la métagénomique permet d'établir un profil taxonomique de l'échantillon, la métatranscriptomique fournit un profil fonctionnel en analysant les gènes exprimés par la communauté. Il est possible de déduire quels gènes sont exprimés dans des conditions spécifiques, grâce aux annotations fonctionnelles des gènes exprimés.

La métatranscriptomique, en se concentrant sur les gènes exprimés, permet de caractériser le profil fonctionnel actif de l'ensemble de la communauté microbienne. L'aperçu de l'expression génique dans un échantillon donné est obtenu en capturant l' ARNm total du microbiome et en effectuant un séquençage shotgun métatranscriptomique complet .

Bien que les puces à ADN puissent être utilisées pour déterminer les profils d'expression génique de certains organismes modèles, le séquençage de nouvelle génération (NGS) et le séquençage de troisième génération (G3G) sont les techniques de choix en métatranscriptomique. Le protocole d'analyse du métatranscriptome peut varier selon le type d'échantillon. De nombreux protocoles ont été développés pour l'étude du métatranscriptome d'échantillons microbiens. Les étapes comprennent généralement la récolte de l'échantillon, l'extraction d'ARN (différentes méthodes d'extraction selon le type d'échantillon ont été décrites dans la littérature), l'enrichissement en ARNm, la synthèse d'ADNc et la préparation des banques métatranscriptomiques, le séquençage, ainsi que le traitement et l'analyse des données. L'enrichissement en ARNm est l'une des étapes les plus complexes sur le plan technique, et différentes stratégies ont été proposées pour la réaliser.

• élimination de l'ARNr par capture d'ARN ribosomique
• en utilisant une exonucléase 5-3 pour dégrader les ARN traités (principalement l'ARNr et l'ARNt )
• ajout de poly(A) aux ARNm à l'aide d'une polyA polymérase (chez E. coli )
• utilisation d'anticorps pour capturer les ARNm qui se lient à des protéines spécifiques

Les deux dernières stratégies ne sont pas recommandées car elles seraient fortement biaisées.

Un pipeline d'analyse métatranscriptomique typique :

• mappe les lectures sur un génome de référence , ou
• effectue l'assemblage de novo des lectures en contigs de transcription et en supercontigs

La première stratégie consiste à aligner les séquences de lecture sur des génomes de référence présents dans des bases de données, afin de recueillir des informations utiles pour déduire l'expression relative des gènes individuels. Les séquences métatranscriptomiques sont alignées sur des bases de données à l'aide d'outils d'alignement tels que Bowtie2 , BWA et BLAST . Les résultats sont ensuite annotés à l'aide de ressources telles que GO , KEGG , COG et Swiss-Prot . L'analyse finale des résultats est réalisée en fonction de l'objectif de l'étude. Parmi les techniques métatranscriptomiques les plus récentes figure le traçage isotopique stable (SIP), qui a été utilisé pour récupérer des transcriptomes ciblés spécifiques de micro-organismes aérobies dans des sédiments lacustres . Cette stratégie présente toutefois une limite : sa dépendance aux informations des génomes de référence présents dans les bases de données.

La seconde stratégie consiste à déterminer l'abondance d'expression des différents gènes en assemblant les lectures métatranscriptomiques en fragments plus longs appelés contigs , à l'aide de différents logiciels. Le logiciel Trinity pour le séquençage d'ARN (RNA-seq) , comparé à d'autres assembleurs de transcriptomes de novo, permet de récupérer davantage de transcrits complets sur une large gamme de niveaux d'expression, avec une sensibilité similaire aux méthodes reposant sur l'alignement de génomes. Ceci est particulièrement important en l'absence de génome de référence.

Li et Dewey ont développé un pipeline quantitatif pour l'analyse transcriptomique , appelé RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization). Ce logiciel peut être utilisé de manière autonome ou comme module complémentaire pour Trinity. RSEM utilise un transcriptome ou un assemblage de référence, ainsi que les séquences RNA-Seq générées à partir de l'échantillon, pour calculer l'abondance normalisée des transcrits (c'est-à-dire le nombre de séquences RNA-Seq correspondant à chaque transcriptome ou assemblage de référence).

Bien que Trinity et RSEM aient été conçus pour des jeux de données transcriptomiques (c’est-à-dire obtenus à partir d’un seul organisme), il est possible de les appliquer à des données métatranscriptomiques (c’est-à-dire obtenues à partir d’une communauté microbienne entière).

L’utilisation d’outils d’analyse computationnelle est devenue plus importante avec l’essor du séquençage de l’ADN , notamment en métagénomique et en métatranscriptomique, qui peuvent générer un volume considérable de données. De nombreux pipelines bioinformatiques ont été développés à ces fins, souvent sous forme de plateformes open source telles que HUMAnN et les plus récentes HUMAnN2, MetaTrans, SAMSA, Leimena-2013 et mOTUs2.

Une autre méthode exploitable en métatranscriptomique est celle des puces à ADN . Ces puces ont notamment permis de mesurer les niveaux de transcription microbienne, de détecter de nouveaux transcrits et d'obtenir des informations sur la structure des ARNm (par exemple, les limites des UTR). Plus récemment, elles ont également été utilisées pour identifier de nouveaux ARNnc régulateurs. Cependant, l'utilisation des puces à ADN présente certains inconvénients :

• exigences de conception de la sonde
• faible sensibilité
• Connaissances préalables des cibles génétiques.

Le séquençage d'ARN (RNA-Seq) permet de surmonter ces limitations : il ne nécessite aucune connaissance préalable des génomes à analyser et offre une validation à haut débit de la prédiction, de la structure et de l'expression des gènes. Ainsi, la combinaison des deux approches permet d'obtenir une représentation plus complète du transcriptome bactérien.

• Du fait de son abondance dominante, l'ARN ribosomique réduit fortement la couverture de l'ARNm (généralement l'objet principal des études transcriptomiques) dans l'ARN total collecté.
• L'extraction d'ARN de haute qualité à partir de certains échantillons biologiques ou environnementaux (tels que les matières fécales) peut s'avérer difficile.
• Instabilité de l'ARNm compromettant l'intégrité de l'échantillon avant même le séquençage.
• Des problèmes expérimentaux peuvent affecter la quantification des différences d'expression entre plusieurs échantillons : ils peuvent influencer l'intégrité et la qualité de l'ARN initial, ainsi que la quantité d'ARNr restant dans les échantillons, la taille des fragments et les modèles de gènes. De plus, les techniques moléculaires sont très sensibles aux artefacts.
• Il est difficile de différencier l'ARN de l'hôte de l'ARN microbien, malgré la disponibilité de kits commerciaux d'enrichissement microbien. Cette distinction peut également être effectuée in silico si un génome de référence est disponible pour l'hôte.
• Les bases de données de référence du transcriptome ont une couverture limitée.
• En général, l'analyse métatranscriptomique exploite de vastes populations cellulaires, ce qui rend difficile la mise en évidence d'importantes variations entre les sous-populations. Il a été démontré qu'une forte variabilité au sein des populations de pathogènes influence la progression de la maladie et sa virulence .
• Que ce soit pour les puces à ADN ou le séquençage d'ARN (RNA-Seq), il est difficile de définir un seuil réel pour classer les gènes comme « exprimés », en raison de la grande variabilité de l'expression génique.
• La présence d'ARNm n'est pas toujours associée à la présence réelle de la protéine correspondante.