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Lorsque Pizarro quitta Cuzco avec Almagro et Manco Inca pour Jauja à la poursuite de Quizquiz , Francisco laissa ses jeunes frères Gonzalo et Juan Pizarro comme regidores , ainsi qu'une garnison de quatre-vingt-dix hommes dans la ville. Les frères Pizarro maltraitèrent si durement Manco Inca qu'il tenta finalement de s'évader en 1535. Sa tentative échoua et il fut capturé et emprisonné. Hernando Pizarro le libéra afin qu'il récupère une statue en or de son père, Huayna Capac. Accompagné seulement de deux Espagnols, il s'échappa facilement une seconde fois. Manco rassembla alors une armée de 100 000 guerriers incas et assiégea Cuzco début 1536, profitant de l'absence de Diego de Almagro. Après dix mois (voir le Siège de Cuzco ), Manco se replia sur la forteresse voisine d' Ollantaytambo en 1537. Là, il repoussa les attaques espagnoles lors de la bataille d'Ollantaytambo .
Manco Inca coordonna le siège de Cusco avec celui de Lima, mené par l'un de ses capitaines, Quiso Yupanqui. Les Incas parvinrent à repousser quatre expéditions de secours envoyées par Francisco Pizarro depuis Lima. Près de 500 soldats espagnols périrent dans ces batailles. Certains Espagnols furent capturés et envoyés à Ollantaytambo. Cependant, la position espagnole étant consolidée par les renforts d'Almagro, Manco Inca jugea Ollantaytambo trop proche de Cusco pour être défendable et se retira plus à l'ouest. Abandonnant Ollantaytambo (et cédant de fait les hauts plateaux de l'empire), Manco Inca se replia sur Vitcos , puis finalement dans la jungle reculée de Vilcabamba .
Coexistence avec l'Espagne
À Vilcabamba, Manco établit l'État néo-inca, qui devint sa capitale jusqu'à la mort de Tupaq Amaru en 1572. De là, il poursuivit ses attaques contre les Wankas (l'un des plus importants alliés des Espagnols), remportant quelques succès après de violents combats, puis jusqu'aux hauts plateaux de l'actuelle Bolivie , où son armée fut vaincue après de nombreuses batailles. Après plusieurs guérillas dans les régions montagneuses de Vilcabamba, Manco fut assassiné en 1544 par des partisans de Diego de Almagro, qui avaient auparavant assassiné Francisco Pizarro et qui s'étaient réfugiés sous sa protection. Ils furent à leur tour tous tués par les soldats de Manco.
Manco eut pour successeur son fils Sayri Túpac (Sayri Tupaq), alors âgé de neuf ans. Il devint Inca à Vilcabamba et régna seize ans avec l'aide de régents. Cette période fut marquée par la paix avec les Espagnols. Le vice-roi Pedro de la Gasca proposa à Sayri Túpac des terres et des maisons à Cuzco s'il acceptait de quitter Vilcabamba, alors isolée. Sayri Túpac accepta, mais durant les préparatifs, son parent Paullu Inca mourut subitement. Ce décès fut perçu comme un mauvais présage (ou un signe de trahison espagnole), et Sayri Túpac demeura à Vilcabamba. En 1557, il accepta finalement de quitter la ville et se rendit à Lima auprès du vice-roi Hurtado . Sayri Túpac renonça à ses prétentions à l'Empire inca et reçut le baptême sous le nom de Diego. En échange, il obtint le pardon complet, le titre de prince de Yucay et de vastes domaines aux revenus importants. Il s'installa à Yucay , à une journée de marche au nord-est de Cuzco. Fait significatif, il laissa derrière lui la frange rouge royale, symbole de son autorité.
En 1560, Sayri Túpac mourut subitement et son demi-frère, Titu Cusi Yupanqui, prit le contrôle de Vilcabamba et de la résistance inca contre les Espagnols. Durant son mandat à Vilcabamba, le gouverneur général provisoire, Lope García de Castro, souhaita négocier avec lui. Ces négociations portaient sur le départ de Cusi de Vilcabamba et l'acceptation d'une pension royale. Après une escalade des négociations, vers 1568, Titu Cusi fut baptisé dans l' Église catholique romaine et prit le nom de Diego de Castro.
Túpac Amaru devint souverain inca après la mort subite de Titu Cusi en 1571. À cette époque, les Espagnols ignoraient encore le décès du précédent Sapa Inca (Titu Cusi) et avaient, comme à leur habitude, dépêché deux ambassadeurs pour poursuivre les négociations en cours avec ce dernier. Tous deux furent tués à la frontière par un capitaine inca. Se fondant sur le prétexte que les Incas avaient « violé la loi inviolable observée par toutes les nations du monde concernant les ambassadeurs », le nouveau vice-roi, Francisco de Toledo, comte d'Oropesa , décida d'attaquer et de conquérir Vilcabamba. Il déclara la guerre à l'État néo-inca le 14 avril 1572.
Conquête finale
Deux semaines après la déclaration de guerre, un petit groupe de soldats espagnols s'empara d'un pont stratégique à la frontière de l'État néo-inca, d'où Tolède rassembla son armée. Le 1er juin, le premier affrontement eut lieu dans la vallée de Vilcabamba. Les Incas, malgré leur équipement insuffisant, lancèrent une première attaque empreinte de moral. À plusieurs reprises, ils tentèrent de lever le siège imposé par les Espagnols et leurs alliés indigènes, mais furent contraints de battre en retraite. Le 23 juin, le fort de Aztèques , les Incas étaient également désireux de maîtriser des armes qui leur étaient totalement étrangères. Dès 1537, après la victoire de Manco Inca sur les Espagnols à Pilcosuni, ils entrèrent en possession d'armes espagnoles plus perfectionnées, dont des arquebuses , de l'artillerie et des arbalètes. Vers la fin du siège de Cusco , les Espagnols rapportèrent que les guerriers incas utilisaient avec une certaine habileté des armes à feu capturées ainsi que des chevaux. Manco Inca força même des Européens capturés à raffiner la poudre à canon pour son armée.
Les Incas tentèrent également d'adopter certaines tactiques de combat européennes. À au moins une occasion, un groupe de guerriers incas forma une unité compacte au combat, s'inspirant des enseignements d'un Espagnol capturé, et utilisa ses arcs, frondes et javelots de manière à obtenir un tir plus rapide. En 1538, Manco Inca était suffisamment habile pour mener une bataille à cheval ; à cette époque, lui et trois de ses nobles auraient mené une charge de cavalerie qui anéantit un contingent d'infanterie espagnol de 30 hommes. Cependant, la maîtrise des armes modernes par les Incas était encore lacunaire, et le chroniqueur Pedro Pizarro rapporta que les arquebusiers incas manquaient souvent leurs cibles. Lors des batailles de 1536-1538 entre les Incas et les Espagnols, les armes capturées ne firent aucune différence durable.
Mais au début des années 1540, plusieurs immigrants espagnols arrivés dans l'État néo-inca enseignèrent aux guerriers incas comment utiliser pleinement les armes espagnoles. Au total, il fallut environ deux décennies aux Incas pour combler leur retard technologique sur les Espagnols. Dans les années 1560, on constate que de nombreux Incas avaient acquis une grande habileté dans le maniement des arquebuses et l'équitation.