Pyroséquençage

Le principe du pyroséquençage a été décrit pour la première fois en 1993 par P. Nyrén , B. Pettersson et M. Uhlen . Cette technique combine le séquençage en phase solide et l'utilisation de billes magnétiques recouvertes de streptavidine , d'une ADN polymérase recombinante dépourvue d'activité exonucléase 3'→5' (correction d'épreuves) et de la détection par luminescence du pyrophosphate inorganique à l'aide de l' enzyme luciférase de luciole .

Plus précisément, une solution de trois enzymes — l'ADN polymérase , l'ATP sulfurylase et la luciférase de luciole — et un désoxyribonucléoside triphosphate (dNTP) sont ajoutés à l'ADN simple brin à séquencer. L'incorporation des nucléotides est suivie en mesurant la lumière émise suite à la production de pyrophosphate inorganique. L'intensité lumineuse détermine si 0, 1 ou plusieurs nucléotides ont été incorporés, indiquant ainsi le nombre de nucléotides complémentaires présents sur le brin matrice. Le mélange de nucléotides est retiré avant l'ajout d'un nouveau mélange, et le processus est répété pour chacun des quatre nucléotides, jusqu'à ce que la séquence d'ADN du brin matrice soit déterminée.

Une seconde méthode de pyroséquençage en solution a été décrite en 1998 par Mostafa Ronaghi , Mathias Uhlen et . Cette méthode alternative utilise une enzyme supplémentaire, l'apyrase pour éliminer les nucléotides non incorporés par l'ADN polymérase. Le mélange enzymatique (ADN polymérase, luciférase et apyrase) est ainsi ajouté au début du séquençage et maintenu dans la solution réactionnelle pendant toute la durée de la procédure (facilitant ainsi l'automatisation). Un instrument automatisé basé sur ce principe a été commercialisé l'année suivante par la société Pyrosequencing.

Une troisième variante, une méthode de pyroséquençage microfluidique, a été décrite en 2005 par une équipe de recherche industrielle dirigée par Jonathan Rothberg , au sein de la société 454 Life Sciences . Cette approche alternative du pyroséquençage reposait sur le principe initial de fixation de l'ADN à séquencer sur un support solide. Rothberg et ses collaborateurs ont démontré que le séquençage pouvait être réalisé de manière hautement parallèle grâce à la microfabrication et aux puces à ADN . Ceci a permis le séquençage d'ADN à haut débit, et un instrument automatisé a été commercialisé. Ce premier séquenceur de nouvelle génération a inauguré une nouvelle ère dans la recherche en génomique et a entraîné une chute rapide des prix du séquençage d'ADN , rendant ainsi le séquençage de génomes entiers abordable .

Le séquençage par synthèse consiste à partir d'un brin d'ADN à séquencer, puis à synthétiser son brin complémentaire par voie enzymatique. La méthode de pyroséquençage repose sur la détection de l'activité de l'ADN polymérase (enzyme de synthèse de l'ADN) grâce à une autre enzyme chimioluminescente . Concrètement, cette méthode permet de séquencer un brin d' ADN en synthétisant le brin complémentaire le long de celui-ci, paire de bases à la fois, et en détectant la base ajoutée à chaque étape. L'ADN matrice est immobile, et des solutions de nucléotides A, C, G et T sont ajoutées et retirées successivement du milieu réactionnel. La lumière est produite uniquement lorsque la solution de nucléotides est complémentaire de la première base non appariée de la matrice. La séquence des solutions produisant des signaux de chimioluminescence permet de déterminer la séquence de la matrice.

Pour la version en solution du pyroséquençage, le modèle d'ADN simple brin ( ssADN ) est hybridé à une amorce de séquençage et incubé avec les enzymes ADN polymérase , ATP sulfurylase , luciférase et apyrase , et avec les substrats adénosine 5' phosphosulfate (APS) et luciférine .

1. L'ajout de l'un des quatre désoxynucléotides triphosphates initie la deuxième étape ; le dNTP (dATPαS, qui n'est pas un substrat de la luciférase, est ajouté à la place du dATP pour éviter le bruit de fond). L'ADN polymérase incorpore les dNTP corrects et complémentaires sur la matrice. Cette incorporation libère du pyrophosphate (PPi).

1. L'ATP sulfurylase convertit le PPi en ATP en présence d'adénosine 5'-phosphosulfate. Cet ATP sert de substrat à la luciférase, qui convertit la luciférine en oxyluciférine, générant ainsi de la lumière visible en quantité proportionnelle à la quantité de PPi. La lumière produite lors de la réaction catalysée par la luciférase est détectée par une caméra et analysée par un logiciel.

1. Les nucléotides non incorporés et l'ATP sont dégradés par l' apyrase , et la réaction peut redémarrer avec un autre nucléotide.

Le processus peut être représenté par les équations suivantes :

• PPi + APS → ATP + Sulfate (catalysé par l'ATP-sulfurylase) ;
• ATP + luciférine + O2 → AMP + PPi + oxyluciférine + CO2 ₊ hv (catalysé par la luciférase) ;

où PPi est le pyrophosphate, APS est l'adénosine 5-phosphosulfate, ATP est l'adénosine triphosphate, O2 est le dioxygène , AMP est l'adénosine monophosphate, CO2 _est le dioxyde de carbone et hv est la lumière.

Actuellement, une limitation de la méthode réside dans la longueur des séquences d'ADN obtenues (de l'ordre de 300 à 500 nucléotides), inférieure aux 800 à 1 000 nucléotides accessibles par les méthodes de séquençage par terminaison de chaîne (comme le séquençage Sanger). Ceci peut complexifier l' assemblage du génome , notamment pour les séquences riches en ADN répétitif . De plus, l'absence de relecture limite la précision de cette méthode.

Pyrosequencing AB, société basée à Uppsala, en Suède , a été fondée grâce à un financement de HealthCap afin de commercialiser des machines et des réactifs pour le séquençage de courts fragments d'ADN par pyroséquençage. Pyrosequencing AB a été cotée à la Bourse de Stockholm en 1999. Suite à l'acquisition de Biotage LLC, société américaine, et d'autres entreprises en 2003, Pyrosequencing AB a été renommée Biotage AB. Les activités de pyroséquençage et autres activités biomédicales de Biotage AB ont été vendues à Qiagen en 2008. La technologie de pyroséquençage a été concédée sous licence à 454 Life Sciences . 454 a développé une technologie de pyroséquençage sur puce à ADN qui s'est imposée comme une plateforme pour le séquençage d'ADN à grande échelle , notamment le séquençage du génome et la métagénomique .

Roche a acquis 454 Life Sciences et a annoncé l'arrêt de la plateforme de séquençage 454 en 2013. La plateforme de séquençage 454 a été remplacée, en partie, par le séquençage par colorant Illumina et par les produits de séquençage d'Applied Biosystems.

• Harrington, Connecticut ; Lin, IE; Olson, MT et Eshleman, JR (1er septembre 2013). "Fondamentaux du pyroséquençage" . Cambre. Pathol. Laboratoire. Méd . 137 (9) : 1296-1303 . est ce que je : 10.5858/arpa.2012-0463-RA . PMID 23991743 2025 .{{cite journal}}: CS1 maint : noms multiples : liste des auteurs ( lien )Pour consulter le document PDF correspondant, veuillez suivre ce lien .

• Metzker M. (2005). « Technologies émergentes en séquençage de l’ADN » . Genome Research . 15 (12) : 1767–76 . doi : 10.1101/gr.3770505 . PMID 16339375 .