Microscopie à force atomique

Le fonctionnement de l'AFM est généralement décrit comme l'un des trois modes suivants, selon la nature du mouvement de la pointe : le mode contact, également appelé mode statique (par opposition aux deux autres modes, appelés modes dynamiques) ; le mode tapping, également appelé contact intermittent, mode AC ou mode vibrant, ou, d'après le mécanisme de détection, AFM à modulation d'amplitude ; et le mode sans contact, ou, toujours d'après le mécanisme de détection, AFM à modulation de fréquence.

Malgré la nomenclature, un contact répulsif peut se produire ou être évité aussi bien en AFM à modulation d'amplitude qu'en AFM à modulation de fréquence, selon les réglages.

Dans des conditions ambiantes, la plupart des échantillons développent une couche de ménisque liquide. De ce fait, maintenir la pointe de la sonde suffisamment près de l'échantillon pour que les forces à courte portée soient détectables, tout en évitant que la pointe n'adhère à la surface, représente un défi majeur en mode contact dans ces conditions. Le mode contact dynamique (également appelé contact intermittent, mode AC ou mode tapping) a été développé pour contourner ce problème. Actuellement, le mode tapping est le mode AFM le plus fréquemment utilisé en conditions ambiantes ou en présence de liquides.

En mode de contact intermittent , le levier est excité pour osciller verticalement à sa fréquence de résonance ou à proximité. Cette oscillation est généralement obtenue grâce à un petit élément piézoélectrique intégré au support du levier, mais d'autres possibilités incluent un champ magnétique alternatif (avec des leviers magnétiques), des leviers piézoélectriques ou un chauffage périodique par faisceau laser modulé. L'amplitude de cette oscillation varie généralement de quelques nanomètres à 200 nm. En mode de contact intermittent, la fréquence et l'amplitude du signal d'excitation sont maintenues constantes, ce qui garantit une amplitude d'oscillation constante du levier tant qu'il n'y a pas de dérive ni d'interaction avec la surface. L'interaction des forces agissant sur le levier lorsque sa pointe s'approche de la surface ( forces de van der Waals , interactions dipôle-dipôle , forces électrostatiques , etc.) provoque une variation (généralement une diminution) de l'amplitude d'oscillation du levier à mesure que la pointe se rapproche de l'échantillon. Cette amplitude est utilisée comme paramètre pour le servomoteur électronique qui contrôle la hauteur du levier au-dessus de l'échantillon. Le servomoteur ajuste la hauteur pour maintenir une amplitude d'oscillation du levier constante lors du balayage de l'échantillon. Une image AFM en mode tapping est ainsi produite en visualisant la force des contacts intermittents entre la pointe et la surface de l'échantillon.

Bien que les forces de pointe appliquées lors de la phase de contact de l'oscillation puissent être bien supérieures à celles généralement utilisées en mode contact, le mode de balayage intermittent (ou tapping) réduit généralement les dommages causés à la surface et à la pointe. Ceci s'explique par la courte durée de la force appliquée et par le fait que les forces latérales entre la pointe et l'échantillon sont significativement plus faibles en mode de balayage intermittent qu'en mode contact. L'imagerie en mode de balayage intermittent est suffisamment douce pour la visualisation de bicouches lipidiques supportées ou de molécules de polymères uniques adsorbées (par exemple, des chaînes de polyélectrolytes synthétiques de 0,4 nm d'épaisseur ) en milieu liquide. Avec des paramètres de balayage appropriés, la conformation de molécules uniques peut rester inchangée pendant des heures , et il est même possible d'imager des moteurs moléculaires uniques en mouvement.

En mode de fonctionnement par contact intermittent, la phase d'oscillation du levier par rapport au signal d'excitation peut également être enregistrée. Ce canal de signal contient des informations sur l'énergie dissipée par le levier à chaque cycle d'oscillation. Les échantillons présentant des zones de rigidité variable ou des propriétés d'adhérence différentes peuvent révéler un contraste dans ce canal, invisible sur l'image topographique. Cependant, l'extraction quantitative des propriétés du matériau de l'échantillon à partir des images de phase est souvent impossible.

En microscopie à force atomique sans contact , l'extrémité du levier ne touche pas la surface de l'échantillon. Le levier oscille soit à sa fréquence de résonance (modulation de fréquence), soit à une fréquence légèrement supérieure (modulation d'amplitude), l'amplitude d'oscillation étant généralement de quelques nanomètres (< 10 nm) à quelques picomètres . Les forces de van der Waals , maximales entre 1 et 10 nm au-dessus de la surface, ou toute autre force à longue portée s'étendant au-dessus de la surface, tendent à diminuer la fréquence de résonance du levier. Cette diminution, combinée à un système de rétroaction, maintient une amplitude ou une fréquence d'oscillation constante en ajustant la distance moyenne pointe-échantillon. La mesure de cette distance à chaque point de données (x, y) permet au logiciel d'acquisition de construire une image topographique de la surface de l'échantillon.

Le mode AFM sans contact ne souffre pas de la dégradation de la pointe ou de l'échantillon parfois observée après de nombreux balayages en mode contact. Ceci rend l'AFM sans contact préférable à l'AFM avec contact pour la mesure d'échantillons mous, tels que les échantillons biologiques et les films minces organiques . Dans le cas d'échantillons rigides, les images obtenues en mode contact et sans contact peuvent être identiques. Cependant, si quelques monocouches de fluide adsorbé sont présentes à la surface d'un échantillon rigide, les images peuvent être très différentes. Un AFM fonctionnant en mode contact pénètre la couche liquide pour imager la surface sous-jacente, tandis qu'en mode sans contact, il oscille au-dessus de la couche de fluide adsorbé pour imager à la fois le liquide et la surface.

Les schémas de fonctionnement en mode dynamique comprennent la modulation de fréquence, où une boucle à verrouillage de phase est utilisée pour suivre la fréquence de résonance du levier, et la modulation d'amplitude, plus courante , avec une boucle d'asservissement pour maintenir l'excitation du levier à une amplitude définie. En modulation de fréquence, les variations de la fréquence d'oscillation fournissent des informations sur les interactions pointe-échantillon. La fréquence peut être mesurée avec une très grande sensibilité, ce qui permet l'utilisation de leviers très rigides. Ces leviers rigides assurent une grande stabilité au voisinage de la surface et, de ce fait, cette technique a été la première technique AFM à fournir une véritable résolution atomique sous ultravide .

En modulation d'amplitude , les variations d'amplitude ou de phase de l'oscillation fournissent le signal de rétroaction pour l'imagerie. En modulation d'amplitude, les variations de phase de l'oscillation permettent de distinguer différents types de matériaux en surface. La modulation d'amplitude peut fonctionner en mode sans contact ou en mode de contact intermittent. En mode de contact dynamique, le levier oscille de manière à moduler la distance entre son extrémité et la surface de l'échantillon.

La modulation d'amplitude a également été utilisée en régime sans contact pour obtenir des images à résolution atomique en utilisant des microleviers très rigides et de faibles amplitudes dans un environnement à ultra-vide.

La formation d'images est une méthode de représentation graphique qui génère une carte colorée en modifiant la position x-y de la pointe lors du balayage et de l'enregistrement de la variable mesurée, c'est-à-dire l'intensité du signal de contrôle, pour chaque coordonnée x-y. La carte colorée indique la valeur mesurée correspondant à chaque coordonnée. L'image exprime l'intensité d'une valeur par une teinte. Généralement, la correspondance entre l'intensité d'une valeur et une teinte est indiquée par une échelle de couleurs dans les notes explicatives accompagnant l'image.

Le mode de fonctionnement de la formation d'image du microscope à force atomique (AFM) est généralement classé en deux groupes selon qu'il utilise ou non une boucle de rétroaction Z (non représentée) pour maintenir la distance pointe-échantillon et ainsi conserver l'intensité du signal capté par le détecteur. Le premier (avec boucle de rétroaction Z) est appelé « mode XX constant » ( XX étant une valeur maintenue par la boucle de rétroaction Z).

Le mode de formation d'image topographique est basé sur le « mode XX constant » susmentionné. La boucle de rétroaction z contrôle la distance relative entre la sonde et l'échantillon en émettant des signaux de contrôle pour maintenir constants la fréquence, la vibration et la phase, ce qui correspond généralement au mouvement du cantilever (par exemple, une tension est appliquée à l'élément piézoélectrique Z et celui-ci déplace l'échantillon de haut en bas dans la direction Z).

Outre l'imagerie, la microscopie à force atomique (AFM) peut être utilisée pour la spectroscopie de force , c'est-à-dire la mesure directe des forces d'interaction pointe-échantillon en fonction de la distance entre la pointe et l'échantillon. Le résultat de cette mesure est appelé courbe force-distance. Pour cette méthode, la pointe de l'AFM est avancée puis rétractée de la surface, tandis que la déflexion du levier est enregistrée en fonction du déplacement piézoélectrique . Ces mesures ont permis de mesurer les contacts à l'échelle nanométrique, les liaisons atomiques , les forces de Van der Waals et de Casimir , les forces de dissolution dans les liquides, ainsi que les forces d'étirement et de rupture de molécules uniques . L'AFM a également été utilisée pour mesurer, en milieu aqueux, la force de dispersion due à un polymère adsorbé sur le substrat . Des forces de l'ordre de quelques piconewtons peuvent désormais être mesurées de façon routinière avec une résolution spatiale verticale inférieure à 0,1 nanomètre. La spectroscopie de force peut être réalisée en modes statique et dynamique. En mode dynamique, les informations relatives à la vibration du levier sont enregistrées en plus de la déflexion statique.

Les problèmes liés à cette technique incluent l'absence de mesure directe de la distance pointe-échantillon et la nécessité fréquente d'utiliser des microleviers de faible rigidité, qui ont tendance à se coller à la surface. Ces problèmes ne sont pas insurmontables. Un microscope à force atomique (AFM) mesurant directement la distance pointe-échantillon a été développé . Ce phénomène de collage peut être réduit en effectuant des mesures en milieu liquide ou en utilisant des microleviers plus rigides, mais dans ce dernier cas, un capteur de déflexion plus sensible est nécessaire. En appliquant une légère oscillation à la pointe, la rigidité (gradient de force) de la liaison peut également être mesurée

Le microscope à force atomique (AFM) permet d'imager les atomes et les structures sur diverses surfaces. L'atome situé à l'extrémité de la pointe « détecte » les atomes individuels de la surface sous-jacente lorsqu'il initie la formation de liaisons chimiques avec chacun d'eux. Ces interactions chimiques modifiant subtilement la fréquence de vibration de la pointe, elles peuvent être détectées et cartographiées. Ce principe a été utilisé pour distinguer les atomes de silicium, d'étain et de plomb sur une surface d'alliage, en comparant leurs signatures atomiques à des valeurs obtenues par simulations de la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT).

Les forces d'interaction doivent être mesurées avec précision pour chaque type d'atome présent dans l'échantillon, puis comparées aux forces calculées par simulations DFT. Il a été constaté que la pointe interagissait le plus fortement avec les atomes de silicium, et que l'interaction était respectivement 24 % et 41 % plus faible avec les atomes d'étain et de plomb. Grâce à ces informations, chaque type d'atome présent dans la matrice a pu être identifié comme étant la pointe.

Une sonde AFM possède une pointe acérée à l'extrémité libre d'un levier qui dépasse d'un support. Les dimensions du levier sont de l'ordre du micromètre. Le rayon de courbure de la pointe est généralement de l'ordre de quelques nanomètres à quelques dizaines de nanomètres. (Il existe des sondes spécialisées avec des rayons de courbure beaucoup plus importants, par exemple des sondes pour l'indentation de matériaux mous.) Le support du levier, également appelé puce porte-levier (souvent de 1,6 mm × 3,4 mm), permet à l'opérateur de manipuler l'ensemble levier/sonde AFM avec des pinces et de l'insérer dans les clips de fixation correspondants sur la tête de balayage du microscope à force atomique.

Ce dispositif est généralement appelé « sonde AFM », mais on le désigne aussi par les termes « pointe AFM » ou « levier » (le nom d'une seule pièce désignant alors l'ensemble du dispositif). Une sonde AFM est un type particulier de sonde SPM.

Les sondes AFM sont fabriquées à l'aide de la technologie MEMS . La plupart des sondes AFM utilisées sont en silicium (Si), mais on utilise également du verre borosilicaté et du nitrure de silicium . Les sondes AFM sont considérées comme des consommables, car elles sont souvent remplacées lorsque la pointe s'émousse ou se contamine, ou lorsque le levier est cassé. Leur prix peut varier de quelques dizaines de dollars à plusieurs centaines de dollars par levier pour les combinaisons levier/sonde les plus spécialisées.

Pour utiliser l'appareil, la pointe est approchée très près de la surface de l'objet étudié, et le levier est dévié par l'interaction entre la pointe et la surface ; c'est précisément ce que le microscope à force atomique (AFM) est conçu pour mesurer. Une cartographie spatiale de cette interaction peut être réalisée en mesurant la déviation en de nombreux points d'une surface bidimensionnelle.

Plusieurs types d'interactions peuvent être détectés. Selon l'interaction étudiée, la surface de la pointe de la sonde AFM doit être modifiée par un revêtement. Parmi les revêtements utilisés figurent l'or – pour la liaison covalente de molécules biologiques et la détection de leur interaction avec une surface , le diamant pour une résistance accrue à l'usure et les revêtements magnétiques pour la détection des propriétés magnétiques de la surface étudiée . Une autre solution permet d'obtenir une imagerie magnétique haute résolution : équiper la sonde d'un microSQUID . Les pointes AFM sont fabriquées par micro-usinage du silicium et le positionnement précis de la boucle du microSQUID est réalisé par lithographie par faisceau d'électrons . L'ajout d'un point quantique à l'apex de la pointe d'une sonde conductrice permet l'imagerie du potentiel de surface avec une haute résolution latérale, par microscopie à points quantiques à balayage .

La surface des poutres en porte-à-faux peut également être modifiée. Ces revêtements sont principalement appliqués afin d'accroître la réflectance de la poutre et d'améliorer le signal de déflexion.

Les forces d'interaction entre la pointe et l'échantillon dépendent fortement de la géométrie de la pointe. Diverses études ont été menées ces dernières années pour exprimer ces forces en fonction des paramètres de la pointe.

Parmi les différentes forces s'exerçant entre la pointe et l'échantillon, les forces du ménisque de l'eau sont particulièrement intéressantes, aussi bien en milieu gazeux qu'en milieu liquide. D'autres forces doivent également être prises en compte, telles que la force de Coulomb , les forces de van der Waals , de solvatation , l'hydratation et les forces hydrophobes.

ménisque d'eau

Les forces de ménisque de l'eau sont particulièrement intéressantes pour les mesures AFM dans l'air. En raison de l' humidité ambiante , une fine couche d'eau se forme entre la pointe et l'échantillon lors des mesures dans l'air. La force capillaire résultante engendre une forte attraction qui plaque la pointe contre la surface. De fait, la force d'adhésion mesurée entre la pointe et l'échantillon dans l'air ambiant, même à humidité non nulle, est généralement dominée par les forces capillaires. Il est donc difficile de détacher la pointe de la surface. Pour les échantillons mous, notamment de nombreux polymères et en particulier les matériaux biologiques, cette forte force capillaire adhésive provoque la dégradation, voire la destruction, de l'échantillon lors de l'imagerie en mode contact. Historiquement, ces problèmes ont fortement motivé le développement de l'imagerie dynamique dans l'air (par exemple, le « mode tapping »). Lors de l'imagerie en mode tapping dans l'air, des ponts capillaires se forment toujours. Cependant, dans des conditions d'imagerie appropriées, ces ponts se forment et se rompent à chaque cycle d'oscillation du levier perpendiculaire à la surface, comme le montre l'analyse des courbes d'amplitude et de phase du levier en fonction de la distance. En conséquence, les forces de cisaillement destructives sont largement réduites et des échantillons mous peuvent être étudiés.

Afin de quantifier la force capillaire d'équilibre, il est nécessaire de partir de l'équation de Laplace pour la pression :

où γ _L , est l' énergie de surface et r ₀ et r ₁ sont définis dans la figure.

La pression est appliquée sur une zone de

où θ est l'angle entre la surface de la pointe et la surface du liquide tandis que h est la différence de hauteur entre le liquide environnant et le haut du minisque.

La force qui attire les deux surfaces l'une contre l'autre est

La même formule pourrait également être calculée en fonction de l'humidité relative.

Gao a calculé des formules pour différentes géométries de pointe. Par exemple, la force diminue de 20 % pour une pointe conique par rapport à une pointe sphérique.

Lors du calcul de ces forces, il convient de faire une distinction entre la situation humide sur sèche et la situation humide sur humide.

Pour une pointe sphérique, la force est :

pour sec sur mouillé,

pour mouillé sur mouillé,

où θ est l' angle de contact de la sphère sèche et φ est l'angle d'immersion, comme illustré sur la figure

Pour une pointe conique, la formule devient :

pour sec sur mouillé

pour mouillé sur mouillé

où δ est le demi-angle du cône et r ₀ et h sont des paramètres du profil du ménisque.

Les scanners AFM sont fabriqués à partir d' un matériau piézoélectrique qui se dilate et se contracte proportionnellement à la tension appliquée. Leur allongement ou leur contraction dépend de la polarité de cette tension. Traditionnellement, la pointe ou l'échantillon est monté sur un trépied composé de trois cristaux piézoélectriques, chacun assurant le balayage selon les axes x , y et z . En 1986, année de l'invention de l'AFM, un nouveau scanner piézoélectrique , le scanner tubulaire, a été développé pour la microscopie à effet tunnel (STM) . Par la suite, des scanners tubulaires ont été intégrés aux AFM. Le scanner tubulaire permet de déplacer l'échantillon selon les axes x , y et z grâce à un unique cristal piézoélectrique tubulaire doté d'un contact interne et de quatre contacts externes. Comparé au trépied d'origine, le scanner tubulaire offre l'avantage d'une meilleure isolation vibratoire, grâce à la fréquence de résonance plus élevée de sa structure monobloc, associée à un étage d'isolation à basse fréquence de résonance. En revanche, le mouvement selon l'axe x - y peut induire un mouvement indésirable selon l'axe z, entraînant une distorsion. Une autre conception populaire pour les scanners AFM est la platine à flexion , qui utilise des piézos séparés pour chaque axe et les couple par un mécanisme de flexion.

Les scanners sont caractérisés par leur sensibilité, qui correspond au rapport entre le déplacement du matériau piézoélectrique et la tension appliquée ; autrement dit, par l’allongement ou la contraction du matériau piézoélectrique par volt appliqué. Du fait des différences de matériau ou de taille, la sensibilité varie d’un scanner à l’autre. Elle varie de manière non linéaire en fonction de la taille du balayage. Les scanners piézoélectriques présentent une sensibilité plus élevée en fin de balayage qu’en début de balayage. Ceci induit un comportement différent lors des balayages aller et retour, et provoque une hystérésis entre les deux directions de balayage . Ce phénomène peut être corrigé en appliquant une tension non linéaire aux électrodes piézoélectriques afin de linéariser le déplacement du scanner, puis en calibrant ce dernier en conséquence . L’inconvénient de cette approche réside dans la nécessité d’un réétalonnage, car la tension non linéaire précise requise pour corriger la non-linéarité du mouvement évolue avec le temps (voir ci-dessous). Ce problème peut être contourné en ajoutant un capteur linéaire à la platine porte-échantillon ou à la platine piézoélectrique afin de détecter le déplacement réel du matériau piézoélectrique. Les écarts par rapport au mouvement idéal sont détectés par le capteur, et des corrections sont appliquées au signal de commande piézoélectrique afin de compenser les mouvements non linéaires de l'actionneur piézoélectrique. Ce type de conception est appelé AFM « en boucle fermée ». Les AFM piézoélectriques sans capteur sont appelés AFM « en boucle ouverte ».

La sensibilité des matériaux piézoélectriques diminue de façon exponentielle avec le temps. De ce fait, la majeure partie de la variation de sensibilité se produit durant les premières phases de fonctionnement du scanner. Les scanners piézoélectriques sont testés pendant environ 48 heures avant leur expédition, ce qui permet d'éviter d'importantes variations de sensibilité. Avec le temps, la sensibilité du scanner se stabilise et le réétalonnage devient rare , bien que divers manuels de fabricants recommandent un étalonnage mensuel ou bimensuel des microscopes à force atomique (AFM) en boucle ouverte.

Les efforts récents d'intégration des nanotechnologies et de la recherche biologique ont été couronnés de succès et sont très prometteurs pour l'avenir, notamment dans des domaines tels que la nanobiomécanique . Les nanoparticules étant des vecteurs potentiels pour l'administration de médicaments, les réponses biologiques des cellules à ces nanoparticules sont étudiées en continu afin d'optimiser leur efficacité et d'améliorer leur conception . Pyrgiotakis et al. ont pu étudier l'interaction entre des nanoparticules de CeO₂ _et de Fe₂O₃ et _des cellules en fixant ces nanoparticules à la pointe d'un microscope à force atomique (AFM) [58]. _Des l'AFM pour obtenir des informations supplémentaires sur le comportement des cellules vivantes dans des milieux biologiques. La spectroscopie de force atomique en temps réel (ou nanoscopie) et la spectroscopie de force atomique dynamique ont été utilisées pour étudier les cellules vivantes et les protéines membranaires, ainsi que leur comportement dynamique, à haute résolution, à l'échelle nanométrique. L'imagerie et l'obtention d'informations sur la topographie et les propriétés des cellules ont également permis de mieux comprendre les processus et mécanismes chimiques impliqués dans les interactions intercellulaires et les interactions avec d'autres molécules de signalisation (par exemple, les ligands). Evans et Calderwood ont utilisé la microscopie de force unicellulaire pour étudier les forces d'adhésion cellulaire , la cinétique et la force dynamique des liaisons, ainsi que leur rôle dans des processus chimiques tels que la signalisation cellulaire . Scheuring, Lévy et Rigaud ont passé en revue des études utilisant la microscopie à force atomique (AFM) pour explorer la structure cristalline des protéines membranaires de bactéries photosynthétiques . Alsteen et al. ont utilisé la nanoscopie AFM pour analyser en temps réel l'interaction entre des mycobactéries vivantes et des médicaments antimycobactériens (en particulier l'isoniazide , l'éthionamide , l'éthambutol et la streptomycine ) , illustrant ainsi l'analyse approfondie des interactions pathogène-médicament possible grâce à l'AFM.