Construction d'ADN

Une construction d'ADN est un segment d'ADN conçu artificiellement porté par un vecteur qui peut être utilisé pour incorporer du matériel génétique dans un tissu ou une cellule cible . Une construction d'ADN contient un insert d'ADN , appelé transgène , délivré via un vecteur de transformation qui permet à la séquence d'insert d'être répliquée et/ou exprimée dans la cellule cible. Ce gène peut être cloné à partir d'un gène naturel, ou construit synthétiquement. Le vecteur peut être délivré à l'aide de méthodes physiques, chimiques ou virales. En général, les vecteurs utilisés dans les constructions d'ADN contiennent une origine de réplication , un site de clonage multiple et un marqueur sélectionnable . Certains vecteurs peuvent transporter des éléments régulateurs supplémentaires en fonction du système d'expression impliqué.

Les constructions d'ADN peuvent être aussi petites que quelques milliers de paires de bases (kbp) d'ADN portant un seul gène, en utilisant des vecteurs tels que des plasmides ou des bactériophages , ou aussi grandes que des centaines de kbp pour des études génomiques à grande échelle utilisant un chromosome artificiel. Une construction d'ADN peut exprimer une protéine de type sauvage, empêcher l'expression de certains gènes en exprimant des concurrents ou des inhibiteurs, ou exprimer des protéines mutantes, telles que des mutations par délétion ou des mutations faux-sens . Les constructions d'ADN sont largement adaptées dans la recherche en biologie moléculaire pour des techniques telles que le séquençage de l'ADN, l'expression des protéines et les études de l'ARN.

Le premier vecteur standardisé, pBR220, a été conçu en 1977 par des chercheurs du laboratoire d'Herbert Boyer. Le plasmide contient divers sites d'enzymes de restriction et un gène de résistance aux antibiotiques stable et exempt d'activités de transposon.

En 1982, Jeffrey Vieira et Joachim Messing ont décrit le développement de vecteurs pUC dérivés de M13mp7 qui se composent d'un site de clonage multiple et permettent un séquençage et un clonage plus efficaces à l'aide d'un ensemble d'amorces M13 universelles. Trois ans plus tard, le plasmide pUC19, actuellement très populaire, a été conçu par les mêmes scientifiques.

Le gène d'une séquence d'ADN d'intérêt peut être cloné à partir d'une séquence existante ou développé synthétiquement. Pour cloner une séquence naturelle dans un organisme, l'ADN de l'organisme est d'abord coupé avec des enzymes de restriction , qui reconnaissent les séquences d'ADN et les coupent, autour du gène cible. Le gène peut ensuite être amplifié à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). En général, ce processus comprend l'utilisation de séquences courtes appelées amorces pour s'hybrider initialement à la séquence cible ; en outre, des mutations ponctuelles peuvent être introduites dans les séquences d'amorces puis copiées à chaque cycle afin de modifier la séquence cible.

Il est également possible de synthétiser un brin d'ADN cible pour une construction d'ADN. De courts brins d'ADN appelés oligonucléotides peuvent être développés à l'aide d'une synthèse sur colonne, dans laquelle des bases sont ajoutées une à la fois à un brin d'ADN attaché à une phase solide. Chaque base possède un groupe protecteur pour empêcher la liaison qui n'est pas supprimée jusqu'à ce que la base suivante soit prête à être ajoutée, garantissant qu'elles sont liées dans la séquence correcte. Les oligonucléotides peuvent également être synthétisés sur un microarray, ce qui permet de synthétiser des dizaines de milliers de séquences à la fois, afin de réduire les coûts. Pour synthétiser un gène plus grand, des oligonucléotides sont développés avec des séquences qui se chevauchent aux extrémités, puis joints ensemble. La méthode la plus courante est appelée assemblage par cycle de polymérase (PCA) : les fragments s'hybrident dans les régions qui se chevauchent et sont étendus, et des fragments plus gros sont créés à chaque cycle.

Une fois qu'une séquence a été isolée, elle doit être insérée dans un vecteur . La façon la plus simple de procéder consiste à couper l'ADN du vecteur à l'aide d'enzymes de restriction. Si les mêmes enzymes ont été utilisées pour isoler la séquence cible, les mêmes séquences « en surplomb » seront créées à chaque extrémité, ce qui permettra l'hybridation. Une fois que le gène cible s'est hybridé à l'ADN du vecteur, ils peuvent être joints à l'aide d'une ligase d'ADN . Une stratégie alternative utilise la recombinaison entre les sites homologues du gène cible et la séquence du vecteur, éliminant ainsi le besoin d'enzymes de restriction.

Il existe trois grandes catégories de livraison de constructions d'ADN : physique, chimique et virale. Les méthodes physiques, qui livrent l'ADN en pénétrant physiquement dans la cellule, comprennent la microinjection , l'électroporation et la biolistique . Les méthodes chimiques s'appuient sur des réactions chimiques pour livrer l'ADN et comprennent la transformation avec des cellules rendues compétentes à l'aide de phosphate de calcium ainsi que la livraison via des nanoparticules lipidiques. Les méthodes virales utilisent une variété de vecteurs viraux pour livrer l'ADN, notamment l'adénovirus , le lentivirus et le virus de l'herpès simplex

Outre le gène cible, un vecteur comporte trois éléments importants : une origine de réplication, un marqueur sélectionnable et un site de clonage multiple. Une origine de réplication est une séquence d'ADN qui lance le processus de réplication de l'ADN, permettant au vecteur de se cloner lui-même. Un site de clonage multiple contient des sites de liaison pour plusieurs enzymes de restriction, ce qui facilite l'insertion de différentes séquences d'ADN dans le vecteur. Un marqueur sélectionnable confère un trait qui peut être facilement sélectionné dans une cellule hôte, de sorte qu'il soit possible de déterminer si la transformation a réussi. Les marqueurs sélectionnables les plus courants sont les gènes de résistance aux antibiotiques, de sorte que les cellules hôtes sans la construction mourront lorsqu'elles seront exposées à l'anticorps et que seules les cellules hôtes avec la construction resteront.

• Les plasmides bactériens sont des sections circulaires d'ADN qui se répliquent naturellement dans les bactéries. Les plasmides sont capables de contenir des inserts d'une longueur allant jusqu'à environ 20 kbp. Ces types de constructions contiennent généralement un gène offrant une résistance aux antibiotiques, une origine de réplication, des éléments régulateurs tels que des inhibiteurs de Lac , un polylinker et une étiquette protéique qui facilite la purification des protéines.
• Les vecteurs bactériophages sont des virus qui peuvent infecter les bactéries et répliquer leur propre ADN.
• Les chromosomes artificiels sont couramment utilisés dans les études de projets génomiques en raison de leur capacité à contenir des inserts allant jusqu'à 350 kbp. Ces vecteurs sont dérivés du plasmide F , tirant parti de la grande stabilité et de la capacité de conjugaison introduites par le facteur F.
• Les fosmides sont un hybride entre les plasmides F bactériens et les techniques de clonage des phages λ. Les inserts sont préemballés dans des particules de phage, puis insérés dans la cellule hôte avec la capacité de contenir environ 45 kbp. Ils sont généralement utilisés pour générer une bibliothèque d'ADN en raison de leur stabilité accrue.

Les constructions d'ADN peuvent être utilisées pour produire des protéines, y compris des protéines naturelles et des protéines mutantes modifiées. Ces protéines peuvent être utilisées pour fabriquer des produits thérapeutiques, tels que des produits pharmaceutiques et des anticorps. Les constructions d'ADN peuvent également modifier les niveaux d'expression d'autres gènes en exprimant des séquences régulatrices telles que des promoteurs et des inhibiteurs. En outre, les constructions d'ADN peuvent être utilisées pour la recherche, comme la création de bibliothèques génomiques, le séquençage d'ADN cloné et l'étude de l'expression de l'ARN et des protéines.