Séquençage de Maxam–Gilbert

Le séquençage de Maxam-Gilbert est une méthode de séquençage de l'ADN développée par Allan Maxam et Walter Gilbert en 1976-1977. Cette méthode est basée sur la modification chimique partielle de l'ADN par une nucléobase spécifique et sur le clivage ultérieur du squelette de l'ADN aux sites adjacents aux nucléotides modifiés .

Le séquençage Maxam-Gilbert a été la première méthode largement adoptée pour le séquençage de l'ADN et, avec la méthode Sanger didesoxy , représente la première génération de méthodes de séquençage de l'ADN. Le séquençage Maxam-Gilbert n'est plus largement utilisé, ayant été supplanté par les méthodes de séquençage de nouvelle génération .

Bien que Maxam et Gilbert aient publié leur méthode de séquençage chimique deux ans après que Frederick Sanger et Alan Coulson aient publié leurs travaux sur le séquençage plus-minus, le séquençage Maxam-Gilbert est rapidement devenu plus populaire, car l'ADN purifié pouvait être utilisé directement, alors que la méthode initiale de Sanger nécessitait que chaque début de lecture soit cloné pour la production d'ADN monocaténaire. Cependant, avec l'amélioration de la méthode de terminaison de chaîne (voir ci-dessous), le séquençage Maxam-Gilbert est tombé en désuétude en raison de sa complexité technique interdisant son utilisation dans les kits de biologie moléculaire standard, de l'utilisation intensive de produits chimiques dangereux et des difficultés de mise à l'échelle.

L'article de 1977 d'Allan Maxam et Walter Gilbert intitulé « Une nouvelle méthode de séquençage de l'ADN » a été récompensé par un prix Citation for Chemical Breakthrough de la Division of History of Chemistry de l'American Chemical Society pour 2017. Il a été présenté au Département de biologie moléculaire et cellulaire de l'Université Harvard.

Le séquençage de Maxam–Gilbert nécessite un marquage radioactif à une extrémité 5' du fragment d'ADN à séquencer (généralement par une réaction de kinase utilisant le gamma- 32P ^ATP ) et une purification de l'ADN. Le traitement chimique génère des cassures sur une petite proportion d'une ou deux des quatre bases nucléotidiques dans chacune des quatre réactions (G, A+G, C, C+T). Par exemple, les purines (A+G) sont dépurinées à l'aide d'acide formique , les guanines (et dans une certaine mesure les adénines ) sont méthylées par le sulfate de diméthyle et les pyrimidines (C+T) sont hydrolysées à l'aide d'hydrazine . L'ajout de sel ( chlorure de sodium ) à la réaction d'hydrazine inhibe la réaction de la thymine pour la réaction C-only. Les ADN modifiés peuvent ensuite être clivés par la pipéridine chaude ; (CH2 ₎ 5NH _à la position de la base modifiée. La concentration des substances chimiques modificatrices est contrôlée de manière à introduire en moyenne une modification par molécule d'ADN. Ainsi, une série de fragments marqués est générée, depuis l'extrémité radiomarquée jusqu'au premier site de « coupure » de chaque molécule.

Les fragments des quatre réactions sont soumis à une électrophorèse côte à côte dans des gels d'acrylamide dénaturants pour la séparation par taille. Pour visualiser les fragments, le gel est exposé à un film à rayons X pour l'autoradiographie , produisant une série de bandes sombres montrant chacune l'emplacement de molécules d'ADN radiomarquées identiques. La présence et l'absence de certains fragments permettent de déduire la séquence.

Cette méthode a conduit au test d'interférence de méthylation, utilisé pour cartographier les sites de liaison à l'ADN pour les protéines de liaison à l'ADN .

Un protocole de séquençage automatisé Maxam–Gilbert a été développé en 1994.