Cosmide

Un cosmide est un type de plasmide hybride qui contient une séquence cos du phage Lambda . Souvent utilisés comme vecteurs de clonage en génie génétique , les cosmides peuvent être utilisés pour construire des bibliothèques génomiques . Ils ont été décrits pour la première fois par Collins et Hohn en 1978. kb (normalement 45) d'ADN, les limites étant basées sur la taille normale de l'emballage du bactériophage. Ils peuvent se répliquer sous forme de plasmides s'ils ont une origine de réplication (ori) appropriée : par exemple SV40 ori dans les cellules de mammifères, ColE1 ori pour la réplication de l'ADN double brin, ou f1 ori pour la réplication de l'ADN simple brin chez les procaryotes . Ils contiennent également fréquemment un gène de sélection tel que la résistance aux antibiotiques , de sorte que les cellules transformées peuvent être identifiées par placage sur un milieu contenant l'antibiotique. Les cellules qui n'absorbent pas le cosmide seraient incapables de se développer.

Contrairement aux plasmides, ils peuvent également être empaquetés in vitro dans des capsides de phages , une étape qui nécessite des extrémités cohésives , également appelées sites cos , également utilisées dans le clonage avec un phage lambda comme vecteur. Cependant, presque tous les gènes lambda ont été supprimés à l'exception de la séquence cos . L'ADN cosmide hybride dans les capsides peut ensuite être transféré dans des cellules bactériennes par transduction . Comme il existe une exigence d'emballage in vitro selon laquelle au moins 38 kb d'ADN sont nécessaires entre les sites cos, le vecteur sans ADN inséré ne sera pas empaqueté (l'instabilité des plasmides est accrue si le nouvel ADN inséré contient de nombreuses répétitions directes ou de l'ADN palindromique (répétitions inversées). Cette instabilité peut être largement contrecarrée en utilisant une bactérie hôte avec des mutations spécifiques affectant la recombinaison de l'ADN (NB L'absence de répétitions inversées a été notée dans la première publication de Hohn & Collins citée ci-dessus ; voir également ).

Les séquences cos ont une longueur d'environ 200 paires de bases et sont essentielles pour l'empaquetage. Elles contiennent un site cosN où l'ADN est coupé à chaque brin, à 12 pb d'intervalle, par la terminase. Cela provoque la linéarisation du cosmide circulaire avec deux « extrémités cohésives » ou « collantes » de 12 pb. (L'ADN doit être linéaire pour s'insérer dans une tête de phage.) Le site cosB contient la terminase pendant qu'elle coupe et sépare les brins. Le site cosQ du cosmide suivant (car la réplication en cercle roulant aboutit souvent à des concatémères linéaires ) est détenu par la terminase après que le cosmide précédent a été emballé, pour éviter la dégradation par les DNases cellulaires .

Les cosmides sont principalement des plasmides avec un oriV bactérien , un marqueur de sélection d'antibiotique et un site de clonage, mais ils portent un, ou plus récemment deux, sites cos dérivés du bactériophage lambda. Selon l'objectif particulier de l'expérience, des cosmides à large spectre d'hôtes, des cosmides navettes ou des cosmides « mammifères » (liés à l'oriV du SV40 et aux marqueurs de sélection des mammifères) sont disponibles. La capacité de chargement des cosmides varie en fonction de la taille du vecteur lui-même, mais se situe généralement autour de 40–45 kb. La procédure de clonage implique la génération de deux bras vecteurs qui sont ensuite joints à l'ADN étranger. La sélection contre l'ADN cosmide de type sauvage se fait simplement par exclusion de taille. Les cosmides forment donc toujours des colonies et non des plaques. De plus, la densité des clones est beaucoup plus faible avec environ 10 ⁵ – 10 ⁶ UFC par μg d'ADN ligaturé.

Après la construction de banques recombinantes lambda ou cosmides, l'ADN total est transféré dans un hôte E. coli approprié via une technique appelée packaging in vitro. Les extraits de packaging nécessaires sont dérivés des lysogènes E. coli cI857 (red-gam-Sam et Dam (assemblage de tête) et Eam (assemblage de queue) respectivement). Ces extraits reconnaîtront et conditionneront les molécules recombinantes in vitro , générant soit des particules de phage matures (vecteurs basés sur lambda) soit des plasmides recombinants contenus dans des coques de phage (cosmides). Ces différences se reflètent dans les différentes fréquences d'infection observées en faveur des vecteurs de remplacement lambda. Cela compense leur capacité de chargement légèrement inférieure. Les bibliothèques de phages sont également stockées et criblées plus facilement que les bibliothèques de cosmides.

ADN cible : l'ADN génomique à cloner doit être découpé en fragments de restriction de taille appropriée. Cette opération est généralement réalisée par restriction partielle suivie d'un fractionnement par taille ou d'une déphosphorylation (à l'aide de la phosphatase intestinale de veau) pour éviter le brouillage des chromosomes, c'est-à-dire la ligature de fragments physiquement non liés.

Les vecteurs couramment utilisés incluent « SuperCos 1 »

Lectures complémentaires

• Stryer, Lubert (1995) Biochimie 4e éd. ISBN 0-7167-2009-4
• Collection Eurekah Biosciences : Virus, @NCBI