Microdialyse

La microdialyse est une technique d'échantillonnage peu invasive utilisée pour la mesure continue des concentrations d'analytes libres et non liés dans le liquide extracellulaire de pratiquement tous les tissus. Les analytes peuvent inclure des molécules endogènes (par exemple, des neurotransmetteurs , des hormones , du glucose , etc.) pour évaluer leurs fonctions biochimiques dans le corps, ou des composés exogènes (par exemple, des produits pharmaceutiques ) pour déterminer leur distribution dans le corps. La technique de microdialyse nécessite l'insertion d'un petit cathéter de microdialyse (également appelé sonde de microdialyse) dans le tissu d'intérêt. La sonde de microdialyse est conçue pour imiter un capillaire sanguin et se compose d'une tige avec une membrane en fibre creuse semi-perméable à son extrémité, qui est connectée à un tube d'entrée et de sortie. La sonde est perfusée en continu avec une solution aqueuse (perfusat) qui ressemble étroitement à la composition (ionique) du liquide tissulaire environnant à un faible débit d'environ 0,1 à 5 μL/min. Une fois insérés dans le tissu ou le liquide (corporel) d'intérêt, les petits solutés peuvent traverser la membrane semi-perméable par diffusion passive . La direction du flux d'analyte est déterminée par le gradient de concentration respectif et permet l'utilisation de sondes de microdialyse comme outils d'échantillonnage et de distribution. La solution quittant la sonde (dialysat) est collectée à certains intervalles de temps pour analyse.

Le principe de la microdialyse a été utilisé pour la première fois au début des années 1960, lorsque des canules push-pull et des sacs de dialyse ont été implantés dans des tissus animaux, en particulier dans le cerveau des rongeurs, pour étudier directement la biochimie des tissus. Bien que ces techniques aient un certain nombre d'inconvénients expérimentaux, tels que le nombre d'échantillons par animal ou l'absence ou la résolution temporelle limitée, l'invention des dialytrodes à perfusion continue en 1972 a permis de surmonter certaines de ces limitations. D'autres améliorations du concept de dialytrode ont abouti à l'invention de la « fibre creuse », une membrane semi-perméable tubulaire d'un diamètre d'environ 200-300 μm, en 1974. La forme la plus répandue aujourd'hui, la sonde à aiguille, se compose d'une tige avec une fibre creuse à son extrémité et peut être insérée au moyen d'une canule de guidage dans le cerveau et d'autres tissus. Une méthode alternative, la microperfusion à flux ouvert (OFM), remplace la membrane par des ouvertures macroscopiques qui facilitent l'échantillonnage des composés lipophiles et hydrophiles, des médicaments liés et non liés aux protéines, des neurotransmetteurs , des peptides et des protéines , des anticorps , des nanoparticules et des nanotransporteurs , des enzymes et des vésicules .

Il existe une grande variété de sondes avec différentes combinaisons de longueur de membrane et de tige. Le seuil de poids moléculaire des sondes de microdialyse disponibles dans le commerce couvre une large gamme d'environ 6 à 100 kD, mais 1 MD est également disponible. Alors que les composés hydrosolubles diffusent généralement librement à travers la membrane de microdialyse, la situation n'est pas aussi claire pour les analytes hautement lipophiles, pour lesquels des expériences de microdialyse réussies (par exemple les corticostéroïdes) et infructueuses (par exemple l'estradiol, l'acide fusidique) ont été rapportées. Cependant, la récupération des composés hydrosolubles diminue généralement rapidement si le poids moléculaire de l'analyte dépasse 25 % du seuil de poids moléculaire de la membrane.

En raison de la perfusion constante de la sonde de microdialyse avec du perfusat frais, un équilibre total ne peut pas être établi. Cela entraîne des concentrations de dialysat inférieures à celles mesurées au site d'échantillonnage distant. Afin de corréler les concentrations mesurées dans le dialysat avec celles présentes au site d'échantillonnage distant, un facteur d'étalonnage (récupération) est nécessaire. La récupération peut être déterminée à l'état stable en utilisant le taux constant d'échange d'analyte à travers la membrane de microdialyse. Le taux auquel un analyte est échangé à travers la membrane semi-perméable est généralement exprimé comme l'efficacité d'extraction de l'analyte. L'efficacité d'extraction est définie comme le rapport entre la perte/le gain d'analyte pendant son passage à travers la sonde (C _in −C _out ) et la différence de concentration entre le perfusat et le site d'échantillonnage distant (C _in −C _sample ).

En théorie, l'efficacité d'extraction d'une sonde de microdialyse peut être déterminée en : 1) modifiant les concentrations de médicament tout en maintenant le débit constant ou 2) modifiant le débit tout en maintenant les concentrations respectives de médicament constantes. À l'état stable, la même valeur d'efficacité d'extraction est obtenue, que l'analyte soit enrichi ou appauvri dans le perfusat. Les sondes de microdialyse peuvent donc être étalonnées soit en mesurant la perte d'analyte à l'aide d'un perfusat contenant un médicament, soit le gain d'analyte à l'aide de solutions d'échantillon contenant un médicament. À ce jour, les méthodes d'étalonnage les plus fréquemment utilisées sont la méthode à faible débit, la méthode sans flux net, la méthode sans flux net dynamique (étendu) et la méthode de rétrodialyse. La sélection appropriée d'une méthode d'étalonnage appropriée est d'une importance cruciale pour le succès d'une expérience de microdialyse. Des expériences in vitro de soutien avant l'utilisation sur des animaux ou des humains sont donc recommandées. De plus, la récupération déterminée in vitro peut différer de la récupération chez l'homme. Sa valeur réelle doit donc être déterminée dans chaque expérience in vivo.

La méthode du faible débit repose sur le fait que l'efficacité d'extraction dépend du débit. À des débits élevés, la quantité de médicament diffusant du site d'échantillonnage dans le dialysat par unité de temps est plus faible (faible efficacité d'extraction) qu'à des débits plus faibles (efficacité d'extraction élevée). À un débit nul, un équilibre total entre ces deux sites est établi (C _out = C _sample ). Ce concept est appliqué à la méthode du (faible) débit, où la sonde est perfusée avec du perfusat à blanc à différents débits. La concentration au site d'échantillonnage peut être déterminée en traçant les ratios d'extraction par rapport aux débits correspondants et en extrapolant à un débit nul. La méthode du faible débit est limitée par le fait que les temps d'étalonnage peuvent être assez longs avant qu'un volume d'échantillon suffisant ait été collecté.

Lors de l'étalonnage avec la méthode sans flux net, la sonde de microdialyse est perfusée avec au moins quatre concentrations différentes de l'analyte d'intérêt (C _in ) et les concentrations à l'état stable de l'analyte quittant la sonde sont mesurées dans le dialysat (C _out ). La ​​récupération pour cette méthode peut être déterminée en traçant C _out −C _in sur C _in et en calculant la pente de la ligne de régression. Si les concentrations d'analyte dans le perfusat sont égales aux concentrations au site d'échantillonnage, aucun flux net ne se produit. Les concentrations respectives au point sans flux net sont représentées par l'intercept x de la ligne de régression. La force de cette méthode est qu'à l'état stable, aucune hypothèse sur le comportement du composé à proximité de la sonde ne doit être faite, puisque l'équilibre existe à un moment et à un endroit spécifiques. Cependant, dans des conditions transitoires (par exemple après une provocation médicamenteuse), la récupération de la sonde peut être altérée, ce qui entraîne des estimations biaisées des concentrations au site d'échantillonnage. Pour surmonter cette limitation, plusieurs approches ont été développées, qui sont également applicables dans des conditions non stationnaires. L'une de ces approches est la méthode dynamique sans flux net.

Alors qu'un seul sujet/animal est perfusé avec plusieurs concentrations au cours de la méthode sans flux net, plusieurs sujets sont perfusés avec une seule concentration au cours de la méthode sans flux net dynamique (DNNF). Les données des différents sujets/animaux sont ensuite combinées à chaque instant pour une analyse de régression permettant de déterminer la récupération au fil du temps. La conception de la méthode d'étalonnage DNNF s'est avérée très utile pour les études qui évaluent la réponse des composés endogènes, tels que les neurotransmetteurs, à la provocation médicamenteuse.

Pendant la rétrodialyse, la sonde de microdialyse est perfusée avec une solution contenant l'analyte et la disparition du médicament de la sonde est surveillée. La récupération pour cette méthode peut être calculée comme le rapport entre le médicament perdu pendant le passage (C _in −C _out ) et le médicament entrant dans la sonde de microdialyse (C _in ). En principe, la rétrodialyse peut être réalisée en utilisant soit l'analyte lui-même (rétrodialyse par médicament) soit un composé de référence (rétrodialyse par étalon) qui ressemble étroitement aux propriétés physicochimiques et biologiques de l'analyte. Bien que la rétrodialyse par médicament ne puisse pas être utilisée pour les composés endogènes car elle nécessite l'absence d'analyte du site d'échantillonnage, cette méthode d'étalonnage est le plus souvent utilisée pour les composés exogènes dans les milieux cliniques.

La technique de microdialyse a connu de nombreux développements depuis sa première utilisation en 1972, lorsqu'elle a été employée pour la première fois pour surveiller les concentrations de biomolécules endogènes dans le cerveau. Le domaine d'application actuel s'est étendu à la surveillance des concentrations libres de composés endogènes et exogènes dans pratiquement tous les tissus. Bien que la microdialyse soit encore principalement utilisée dans les études précliniques sur les animaux (par exemple, les rongeurs de laboratoire, les chiens, les moutons, les porcs), elle est désormais de plus en plus utilisée chez l'homme pour surveiller les concentrations tissulaires de médicaments libres et non liés ainsi que les concentrations interstitielles de cytokines et de métabolites régulateurs en réponse à des perturbations homéostatiques telles que l'alimentation et/ou l'exercice.

Lorsqu'elle est utilisée dans la recherche sur le cerveau, la microdialyse est couramment utilisée pour mesurer les neurotransmetteurs (par exemple la dopamine , la sérotonine , la noradrénaline , l'acétylcholine , le glutamate , le GABA ) et leurs métabolites, ainsi que les petits neuromodulateurs (par exemple l'AMPc , le GMPc , le NO ), les acides aminés (par exemple la glycine , la cystéine , la tyrosine ) et les substrats énergétiques (par exemple le glucose , le lactate , le pyruvate ). Les médicaments exogènes à analyser par microdialyse comprennent les nouveaux antidépresseurs , les antipsychotiques , ainsi que les antibiotiques et de nombreux autres médicaments dont le site d'effet pharmacologique se situe dans le cerveau. Le premier non-métabolite à être analysé par microdialyse in vivo dans le cerveau humain était la rifampicine .

Les applications dans d'autres organes incluent la peau (évaluation de la biodisponibilité et de la bioéquivalence de produits dermatologiques appliqués localement), et la surveillance des concentrations de glucose chez les patients diabétiques (mise en place de sondes intravasculaires ou sous-cutanées). Ce dernier peut même être intégré dans un système de pancréas artificiel pour l'administration automatisée d'insuline.

La microdialyse a également trouvé une application croissante dans la recherche environnementale, en échantillonnant une diversité de composés dans les eaux usées et les solutions du sol, y compris les saccharides, les ions métalliques, les micronutriments, les acides organiques, et l'azote de faible poids moléculaire. Étant donné la nature destructive des méthodes conventionnelles d'échantillonnage du sol, la microdialyse a le potentiel d'estimer les flux d'ions du sol qui reflètent mieux un environnement de sol non perturbé.

1. À ce jour, la microdialyse est la seule technique d'échantillonnage in vivo qui permet de surveiller en continu les concentrations de médicaments ou de métabolites dans le liquide extracellulaire de pratiquement n'importe quel tissu. Selon l'application exacte, les concentrations d'analytes peuvent être surveillées sur plusieurs heures, jours ou même semaines. Les concentrations de tissus extracellulaires libres et non liés présentent dans de nombreux cas un intérêt particulier car elles ressemblent aux concentrations pharmacologiquement actives au niveau ou à proximité du site d'action. La combinaison de la microdialyse avec des techniques d'imagerie modernes, telles que la tomographie par émission de positons , permet en outre de déterminer les concentrations intracellulaires.
2. L'insertion de la sonde à un endroit précis du tissu sélectionné permet en outre d'évaluer les gradients de concentration extracellulaire dus à l'activité du transporteur ou à d'autres facteurs, tels que les différences de perfusion. Elle a donc été suggérée comme la technique la plus appropriée à utiliser pour les études de distribution tissulaire.
3. L'échange d'analyte à travers la membrane semi-perméable et le remplacement constant du liquide d'échantillonnage par un nouveau perfusat empêchent le drainage du liquide du site d'échantillonnage, ce qui permet un échantillonnage sans perte de liquide. La microdialyse peut donc être utilisée sans perturber les conditions tissulaires par une perte locale de liquide ou des artefacts de pression, qui peuvent se produire lors de l'utilisation d'autres techniques, telles que la microinjection ou la perfusion push-pull.
4. La membrane semi-perméable empêche les cellules, les débris cellulaires et les protéines de pénétrer dans le dialysat. En raison de l'absence de protéines dans le dialysat, un nettoyage de l'échantillon avant l'analyse n'est pas nécessaire et la dégradation enzymatique n'est pas un problème.

1. Malgré les progrès scientifiques réalisés pour rendre les sondes de microdialyse plus petites et plus efficaces, la nature invasive de cette technique pose encore certaines limites pratiques et éthiques. Par exemple, il a été démontré que l'implantation d'une sonde de microdialyse peut altérer la morphologie des tissus , ce qui entraîne une perturbation de la microcirculation, du taux de métabolisme ou de l'intégrité des barrières physiologiques, telles que la barrière hémato-encéphalique . Alors que les réactions aiguës à l'insertion de la sonde, telles que les traumatismes liés à l'implantation, nécessitent un temps de récupération suffisant, des facteurs supplémentaires, tels que la nécrose , les réponses inflammatoires ou les processus de cicatrisation des plaies doivent être pris en compte pour l'échantillonnage à long terme, car ils peuvent influencer le résultat expérimental. D'un point de vue pratique, il a été suggéré de réaliser des expériences de microdialyse dans une fenêtre temporelle optimale, généralement 24 à 48 heures après l'insertion de la sonde.
2. La microdialyse a une résolution temporelle et spatiale relativement faible par rapport, par exemple, aux biocapteurs électrochimiques . Alors que la résolution temporelle est déterminée par la longueur des intervalles d'échantillonnage (généralement quelques minutes), la résolution spatiale est déterminée par les dimensions de la sonde. La taille de la sonde peut varier selon les différents domaines d'application et couvre une plage de quelques millimètres (application intracérébrale) jusqu'à quelques centimètres ( application sous-cutanée ) de longueur et quelques centaines de micromètres de diamètre.
3. L'application de la technique de microdialyse est souvent limitée par la détermination de la récupération de la sonde, en particulier pour les expériences in vivo . La détermination de la récupération peut prendre du temps et peut nécessiter des sujets supplémentaires ou des expériences pilotes. La récupération dépend en grande partie du débit : plus le débit est faible, plus la récupération est élevée. Cependant, dans la pratique, le débit ne peut pas être trop diminué car soit le volume d'échantillon obtenu pour l'analyse sera insuffisant, soit la résolution temporelle de l'expérience sera perdue. Il est donc important d'optimiser la relation entre le débit et la sensibilité du test analytique. La situation peut être plus complexe pour les composés lipophiles car ils peuvent coller au tube ou à d'autres composants de la sonde, ce qui entraîne une récupération faible ou nulle de l'analyte.