Microscope optique

Le microscope optique , également appelé microscope optique , est un type de microscope qui utilise généralement la lumière visible et un système de lentilles pour générer des images agrandies de petits objets. Les microscopes optiques sont la conception de microscope la plus ancienne et ont probablement été inventés sous leur forme composite actuelle au XVIIe siècle. Les microscopes optiques de base peuvent être très simples, bien que de nombreuses conceptions complexes visent à améliorer la résolution et le contraste de l'échantillon .

L'objet est placé sur une platine et peut être directement observé à travers un ou deux oculaires du microscope. Dans les microscopes à haute puissance, les deux oculaires montrent généralement la même image, mais avec un microscope stéréo , des images légèrement différentes sont utilisées pour créer un effet 3D. Une caméra est généralement utilisée pour capturer l'image ( micrographie ).

L'échantillon peut être éclairé de diverses manières. Les objets transparents peuvent être éclairés par le dessous et les objets solides peuvent être éclairés par la lumière passant à travers ( champ clair ) ou autour ( champ sombre ) de l'objectif. La lumière polarisée peut être utilisée pour déterminer l'orientation cristalline des objets métalliques. L'imagerie par contraste de phase peut être utilisée pour augmenter le contraste de l'image en mettant en évidence de petits détails d'indice de réfraction différent.

Une gamme d' objectifs avec différents grossissements est généralement fournie montée sur une tourelle, ce qui permet de les faire pivoter et d'offrir la possibilité de zoomer. Le pouvoir de grossissement maximal des microscopes optiques est généralement limité à environ 1000x en raison du pouvoir de résolution limité de la lumière visible. Bien que des grossissements plus importants soient possibles, aucun détail supplémentaire de l'objet n'est résolu.

Les alternatives à la microscopie optique qui n'utilisent pas de lumière visible comprennent la microscopie électronique à balayage , la microscopie électronique à transmission et la microscopie à sonde à balayage , qui peuvent ainsi atteindre des grossissements beaucoup plus importants.

Il existe deux types de microscopes optiques de base : les microscopes simples et les microscopes composés. Un microscope simple utilise la puissance optique d'une seule lentille ou d'un groupe de lentilles pour le grossissement. Un microscope composé utilise un système de lentilles (un ensemble agrandissant l'image produite par un autre) pour obtenir un grossissement beaucoup plus élevé d'un objet. La grande majorité des microscopes de recherche modernes sont des microscopes composés, tandis que certains microscopes numériques commerciaux moins chers sont de simples microscopes à lentille unique. Les microscopes composés peuvent être divisés en une variété d'autres types de microscopes, qui diffèrent par leurs configurations optiques, leur coût et leurs objectifs.

Un microscope simple utilise une lentille ou un ensemble de lentilles pour agrandir un objet par grossissement angulaire seul, donnant au spectateur une image virtuelle agrandie et droite . L'utilisation d'une seule lentille convexe ou de groupes de lentilles se retrouve dans les dispositifs de grossissement simples tels que la loupe , les loupes et les oculaires pour télescopes et microscopes.

Un microscope composé utilise une lentille proche de l'objet observé pour collecter la lumière (appelée lentille objective ), qui focalise une image réelle de l'objet à l'intérieur du microscope (image 1). Cette image est ensuite agrandie par une deuxième lentille ou un groupe de lentilles (appelé oculaire ) qui donne à l'observateur une image virtuelle inversée agrandie de l'objet (image 2). L'utilisation d'une combinaison objectif/oculaire composé permet un grossissement beaucoup plus élevé. Les microscopes composés courants comportent souvent des lentilles d'objectif interchangeables, permettant à l'utilisateur de régler rapidement le grossissement. Un microscope composé permet également des configurations d'éclairage plus avancées, telles que le contraste de phase .

Il existe de nombreuses variantes de conception de microscope optique composé à des fins spécialisées. Certaines d'entre elles sont des différences de conception physique permettant une spécialisation à certaines fins :

• Microscope stéréo , un microscope de faible puissance qui fournit une vue stéréoscopique de l'échantillon, couramment utilisé pour la dissection.
• Le microscope de comparaison possède deux chemins lumineux distincts permettant une comparaison directe de deux échantillons via une image dans chaque œil.
• Microscope inversé , pour étudier des échantillons par le bas ; utile pour les cultures cellulaires en liquide ou pour la métallographie.
• Microscope d'inspection de connecteur à fibre optique, conçu pour l'inspection de l'extrémité du connecteur
• Microscope de voyage , pour l'étude d'échantillons à haute résolution optique .

D'autres variantes de microscope sont conçues pour différentes techniques d'éclairage :

• Microscope pétrographique , dont la conception comprend généralement un filtre polarisant, une platine rotative et une plaque de plâtre pour faciliter l'étude des minéraux ou d'autres matériaux cristallins dont les propriétés optiques peuvent varier selon l'orientation.
• Microscope polarisant , similaire au microscope pétrographique.
• Microscope à contraste de phase , qui applique la méthode d'éclairage à contraste de phase.
• Microscope à épifluorescence , conçu pour l'analyse d'échantillons contenant des fluorophores.
• Microscope confocal , une variante largement utilisée de l'éclairage épifluorescent qui utilise un laser à balayage pour éclairer un échantillon pour la fluorescence.
• Microscope à deux photons , utilisé pour imager la fluorescence plus en profondeur dans les milieux de diffusion et réduire le photoblanchiment, en particulier dans les échantillons vivants.
• Microscope étudiant – un microscope souvent de faible puissance avec des commandes simplifiées et parfois des optiques de mauvaise qualité, conçu pour une utilisation scolaire ou comme instrument de démarrage pour les enfants.
• Ultramicroscope , un microscope optique adapté qui utilise la diffusion de la lumière pour permettre la visualisation de minuscules particules dont le diamètre est inférieur ou proche de la longueur d'onde de la lumière visible (environ 500 nanomètres) ; en grande partie obsolète depuis l'avènement des microscopes électroniques
• Le microscope Raman à pointe améliorée est une variante du microscope optique basé sur la spectroscopie Raman à pointe améliorée , sans limites de résolution traditionnelles basées sur la longueur d'onde. Ce microscope est principalement réalisé sur les plates-formes de microscope à sonde à balayage utilisant tous les outils optiques.

Un microscope numérique est un microscope équipé d'une caméra numérique permettant l'observation d'un échantillon via un ordinateur . Les microscopes peuvent également être partiellement ou totalement contrôlés par ordinateur avec différents niveaux d'automatisation. La microscopie numérique permet une analyse plus poussée d'une image microscopique, par exemple des mesures de distances et de surfaces et la quantification d'une coloration fluorescente ou histologique .

Il existe également dans le commerce des microscopes numériques à faible puissance, appelés microscopes USB . Il s'agit essentiellement de webcams dotées d'un objectif macro à forte puissance et qui n'utilisent généralement pas de transillumination . La caméra est directement connectée au port USB d'un ordinateur pour afficher les images directement sur l'écran. Ils offrent des grossissements modestes (jusqu'à environ 200×) sans avoir besoin d'utiliser d'oculaires et à un coût très faible. L'éclairage à haute puissance est généralement fourni par une ou plusieurs sources LED adjacentes à l'objectif de la caméra.

La microscopie numérique avec des niveaux de lumière très faibles pour éviter d'endommager les échantillons biologiques vulnérables est disponible en utilisant des caméras numériques sensibles au comptage de photons . Il a été démontré qu'une source lumineuse fournissant des paires de photons intriqués peut minimiser le risque d'endommager les échantillons les plus sensibles à la lumière. Dans cette application de l'imagerie fantôme à la microscopie à photons clairsemés, l'échantillon est éclairé par des photons infrarouges, chacun étant corrélé spatialement avec un partenaire intriqué dans la bande visible pour une imagerie efficace par une caméra à comptage de photons.

Les premiers microscopes étaient des loupes à lentille unique avec un grossissement limité, qui remontent au moins à l'utilisation généralisée des lentilles dans les lunettes au 13e siècle.

Les microscopes composés sont apparus pour la première fois en Europe vers 1620 dont un présenté par Cornelis Drebbel à Londres (vers 1621) et un autre exposé à Rome en 1624.

L'inventeur du microscope composé est inconnu, bien que de nombreuses affirmations aient été faites au fil des ans. Parmi celles-ci, une affirmation 35 ans après leur apparition par le fabricant de lunettes néerlandais Johannes Zachariassen selon laquelle son père, Zacharias Janssen , aurait inventé le microscope composé et/ou le télescope dès 1590. Le témoignage de Johannes, que certains considèrent comme douteux, repousse la date de l'invention si loin que Zacharias aurait été un enfant à l'époque, ce qui conduit à spéculer que, pour que l'affirmation de Johannes soit vraie, le microscope composé aurait dû être inventé par le grand-père de Johannes, Hans Martens. Une autre affirmation est que le concurrent de Janssen, Hans Lippershey (qui a déposé le premier brevet de télescope en 1608) a également inventé le microscope composé. D'autres historiens pointent du doigt l'innovateur néerlandais Cornelis Drebbel avec son microscope composé de 1621.

Galilée est parfois cité comme l'inventeur du microscope composé. Après 1610, il a découvert qu'il pouvait fermer la focale de son télescope pour voir de près de petits objets, comme des mouches et/ou qu'il pouvait regarder à travers le mauvais bout en sens inverse pour agrandir de petits objets. Le seul inconvénient était que son télescope de 2 pieds de long devait être étendu à 6 pieds pour voir des objets aussi proches. Après avoir vu le microscope composé construit par Drebbel exposé à Rome en 1624, Galilée a construit sa propre version améliorée. En 1625, Giovanni Faber a inventé le nom de microscope pour le microscope composé que Galilée a soumis à l' Accademia dei Lincei en 1624 (Galileo l'avait appelé le " occhiolino " ou " petit œil "). Faber a inventé le nom à partir des mots grecs μικρόν (micron) signifiant « petit » et σκοπεῖν (skopein) signifiant « regarder », un nom censé être analogue à « télescope », un autre mot inventé par les Lincéens.

Christiaan Huygens , un autre Hollandais, a développé à la fin du XVIIe siècle un système oculaire simple à deux lentilles corrigées achromatiquement , ce qui a constitué un grand pas en avant dans le développement des microscopes. L'oculaire Huygens est toujours fabriqué à ce jour, mais il souffre d'un champ de vision réduit et d'autres inconvénients mineurs.

Antonie van Leeuwenhoek (1632–1724) est crédité d'avoir attiré l'attention des biologistes sur le microscope, même si des lentilles grossissantes simples étaient déjà produites au XVIe siècle. Les microscopes faits maison de Van Leeuwenhoek étaient des microscopes simples, avec une seule lentille très petite mais solide. Ils étaient difficiles à utiliser, mais permettaient à Van Leeuwenhoek de voir des images détaillées. Il a fallu environ 150 ans de développement optique avant que le microscope composé ne soit capable de fournir la même qualité d'image que les microscopes simples de Van Leeuwenhoek, en raison des difficultés de configuration de plusieurs lentilles. Dans les années 1850, John Leonard Riddell , professeur de chimie à l'université de Tulane , a inventé le premier microscope binoculaire pratique alors qu'il effectuait l'une des premières et des plus vastes recherches microscopiques américaines sur le choléra .

Bien que la technologie de base du microscope et de l'optique soient disponibles depuis plus de 400 ans, c'est beaucoup plus récemment que les techniques d'éclairage des échantillons ont été développées pour générer les images de haute qualité que l'on voit aujourd'hui.

En août 1893, August Köhler a développé l'éclairage de Köhler . Cette méthode d'éclairage d'échantillon donne lieu à un éclairage extrêmement uniforme et surmonte de nombreuses limitations des anciennes techniques d'éclairage d'échantillon. Avant le développement de l'éclairage de Köhler, l'image de la source lumineuse, par exemple un filament d'ampoule , était toujours visible dans l'image de l'échantillon.

Le prix Nobel de physique a été décerné au physicien néerlandais Frits Zernike en 1953 pour son développement de l'éclairage à contraste de phase qui permet d'obtenir des images d'échantillons transparents. En utilisant l'interférence plutôt que l'absorption de la lumière, des échantillons extrêmement transparents, tels que des cellules vivantes de mammifères , peuvent être photographiés sans avoir à utiliser de techniques de coloration. À peine deux ans plus tard, en 1955, Georges Nomarski publiait la théorie de la microscopie à contraste interférentiel différentiel , une autre technique d'imagerie basée sur l'interférence .

La microscopie biologique moderne repose en grande partie sur le développement de sondes fluorescentes pour des structures spécifiques à l'intérieur d'une cellule. Contrairement à la microscopie à lumière transilluminée classique, dans la microscopie à fluorescence, l'échantillon est éclairé à travers l'objectif par un ensemble restreint de longueurs d'onde de lumière. Cette lumière interagit avec les fluorophores de l'échantillon qui émettent alors une lumière d'une longueur d'onde plus grande . C'est cette lumière émise qui constitue l'image.

Depuis le milieu du XXe siècle, des colorants chimiques fluorescents, comme le DAPI qui se lie à l'ADN , sont utilisés pour marquer des structures spécifiques dans la cellule. Parmi les développements plus récents, citons l'immunofluorescence , qui utilise des anticorps marqués par fluorescence pour reconnaître des protéines spécifiques dans un échantillon, et des protéines fluorescentes comme la GFP qu'une cellule vivante peut exprimer en la rendant fluorescente.

Tous les microscopes optiques modernes conçus pour l'observation d'échantillons par lumière transmise partagent les mêmes composants de base du trajet optique. En outre, la grande majorité des microscopes ont les mêmes composants « structurels » (numérotés ci-dessous selon l'image de droite) :

• Oculaire (lentille oculaire) (1)
• Tourelle d'objectif, revolver ou tourelle à nez tournant (pour contenir plusieurs objectifs) (2)
• Objectifs (3)
• Boutons de mise au point (pour déplacer la scène)
  • Réglage grossier (4)
  • Réglage fin (5)
• Scène (pour maintenir l'échantillon) (6)
• Source de lumière (une lumière ou un miroir ) (7)
• Diaphragme et condensateur (8)
• Etage mécanique (9)

L' oculaire , ou lentille oculaire, est un cylindre contenant deux ou plusieurs lentilles ; sa fonction est de mettre l'image au point pour l'œil. L'oculaire est inséré dans l'extrémité supérieure du tube du corps. Les oculaires sont interchangeables et de nombreux oculaires différents peuvent être insérés avec différents degrés de grossissement. Les valeurs de grossissement typiques pour les oculaires comprennent 5×, 10× (le plus courant), 15× et 20×. Dans certains microscopes hautes performances, la configuration optique de l'objectif et de l'oculaire sont adaptées pour offrir les meilleures performances optiques possibles. Cela se produit le plus souvent avec les objectifs apochromatiques .

La tourelle d'objectif, le revolver ou le nez rotatif est la pièce qui maintient l'ensemble des lentilles d'objectif. Elle permet à l'utilisateur de basculer entre les lentilles d'objectif.

À l'extrémité inférieure d'un microscope optique composé typique, il y a une ou plusieurs lentilles d'objectif qui collectent la lumière de l'échantillon. L'objectif est généralement dans un boîtier cylindrique contenant une lentille composée d'un ou plusieurs éléments en verre. Il y aura généralement environ trois lentilles d'objectif vissées dans un nez circulaire qui peut être tourné pour sélectionner la lentille d'objectif requise. Ces dispositions sont conçues pour être parfocales , ce qui signifie que lorsque l'on passe d'une lentille à une autre sur un microscope, l'échantillon reste net . Les objectifs de microscope sont caractérisés par deux paramètres, à savoir le grossissement et l'ouverture numérique . Le premier varie généralement de 5× à 100× tandis que le second varie de 0,14 à 0,7, correspondant à des distances focales d'environ 40 à 2 mm, respectivement. Les lentilles d'objectif avec des grossissements plus élevés ont normalement une ouverture numérique plus élevée et une profondeur de champ plus courte dans l'image résultante. Certaines lentilles d'objectif hautes performances peuvent nécessiter des oculaires adaptés pour offrir les meilleures performances optiques.

Certains microscopes utilisent des objectifs à immersion dans l'huile ou dans l'eau pour une meilleure résolution à fort grossissement. Ceux-ci sont utilisés avec un matériau d'adaptation d'indice tel que de l'huile d'immersion ou de l'eau et une lamelle de protection adaptée entre la lentille d'objectif et l'échantillon. L'indice de réfraction du matériau d'adaptation d'indice est supérieur à celui de l'air, ce qui permet à la lentille d'objectif d'avoir une ouverture numérique plus grande (supérieure à 1) de sorte que la lumière est transmise de l'échantillon à la face extérieure de la lentille d'objectif avec une réfraction minimale. Des ouvertures numériques aussi élevées que 1,6 peuvent être obtenues. L'ouverture numérique plus grande permet de collecter plus de lumière, ce qui rend possible une observation détaillée des petits détails. Une lentille à immersion dans l'huile a généralement un grossissement de 40 à 100×.

Les boutons de réglage déplacent la platine vers le haut et vers le bas avec un réglage séparé pour la mise au point grossière et fine. Les mêmes commandes permettent au microscope de s'adapter à des échantillons d'épaisseur différente. Dans les anciens modèles de microscopes, les molettes de réglage de la mise au point déplacent le tube du microscope vers le haut ou vers le bas par rapport au support et disposent d'une platine fixe.

L'ensemble optique est traditionnellement fixé sur un bras rigide, lui-même fixé sur un pied robuste en U pour assurer la rigidité nécessaire. L'angle du bras peut être réglable pour permettre d'ajuster l'angle de vision.

Le cadre fournit un point de montage pour diverses commandes du microscope. En général, il s'agit de commandes de mise au point, généralement une grande molette moletée pour régler la mise au point grossière, ainsi qu'une molette plus petite pour contrôler la mise au point fine. D'autres fonctions peuvent être des commandes de lampe et/ou des commandes de réglage du condenseur.

La platine est une plate-forme située sous l'objectif qui supporte l'échantillon à observer. Au centre de la platine se trouve un trou à travers lequel passe la lumière pour éclairer l'échantillon. La platine est généralement dotée de bras pour maintenir les lames (plaques de verre rectangulaires de dimensions typiques de 25 × 75 mm, sur lesquelles l'échantillon est monté).

À des grossissements supérieurs à 100×, il n'est pas pratique de déplacer une lame à la main. Une platine mécanique, typique des microscopes de prix moyen et élevé, permet de petits mouvements de la lame via des boutons de commande qui repositionnent l'échantillon/la lame comme souhaité. Si un microscope n'était pas équipé à l'origine d'une platine mécanique, il peut être possible d'en ajouter une.

Toutes les platines se déplacent de haut en bas pour la mise au point. Avec une platine mécanique, les glissières se déplacent sur deux axes horizontaux pour positionner l'échantillon afin d'examiner les détails de l'échantillon.

La mise au point commence à un grossissement plus faible afin que l'utilisateur puisse centrer l'échantillon sur la platine. Le passage à un grossissement plus élevé nécessite de déplacer la platine plus haut verticalement pour effectuer la mise au point à un grossissement plus élevé et peut également nécessiter un léger ajustement de la position horizontale de l'échantillon. Les ajustements de la position horizontale de l'échantillon sont la raison d'être d'une platine mécanique.

En raison de la difficulté de préparer les échantillons et de les monter sur des lames, il est préférable pour les enfants de commencer avec des lames préparées qui sont centrées et se mettent au point facilement quel que soit le niveau de mise au point utilisé.

De nombreuses sources de lumière peuvent être utilisées. Dans sa forme la plus simple, la lumière du jour est dirigée par un miroir . La plupart des microscopes disposent cependant de leur propre source de lumière réglable et contrôlable, souvent une lampe halogène , bien que l'éclairage à LED et au laser soit de plus en plus courant. L'éclairage Köhler est souvent fourni sur les instruments plus coûteux.

Le condenseur est une lentille conçue pour focaliser la lumière de la source d'éclairage sur l'échantillon. Le condenseur peut également inclure d'autres fonctionnalités, telles qu'un diaphragme et/ou des filtres, pour gérer la qualité et l'intensité de l'éclairage. Pour les techniques d'éclairage telles que la microscopie à fond noir , à contraste de phase et à contraste interférentiel différentiel, des composants optiques supplémentaires doivent être alignés avec précision sur le trajet de la lumière.

La puissance ou le grossissement réel d'un microscope optique composé est le produit des puissances de l' oculaire et de l'objectif. Par exemple, un grossissement de 10x de l'oculaire et de 100x de l'objectif donne un grossissement total de 1 000×. Des environnements modifiés tels que l'utilisation d'huile ou de lumière ultraviolette peuvent augmenter la résolution et permettre d'obtenir des détails clairs à des grossissements supérieurs à 1 000x.

Il existe de nombreuses techniques permettant de modifier le trajet de la lumière pour générer une image à contraste amélioré à partir d'un échantillon. Les principales techniques permettant de générer un contraste accru à partir de l'échantillon comprennent la lumière polarisée croisée , le fond noir , le contraste de phase et l'éclairage à contraste interférentiel différentiel . Une technique récente ( Sarfus ) combine la lumière polarisée croisée et des lames spécifiques à contraste amélioré pour la visualisation d'échantillons nanométriques.

• Quatre exemples de techniques de transillumination utilisées pour générer un contraste dans un échantillon de papier de soie . 1,559 μm/pixel.
• 
  Éclairage en champ clair , le contraste de l'échantillon provient de l'absorption de la lumière dans l'échantillon.
• 
  Éclairage à lumière polarisée croisée , le contraste de l'échantillon provient de la rotation de la lumière polarisée à travers l'échantillon.
• 
  Éclairage en champ sombre , le contraste de l'échantillon provient de la lumière diffusée par l'échantillon.
• 
  Éclairage à contraste de phase , le contraste de l'échantillon provient de l'interférence de différentes longueurs de trajet de lumière à travers l'échantillon.

Les microscopes modernes permettent bien plus que l'observation d'une image en lumière transmise d'un échantillon ; il existe de nombreuses techniques permettant d'extraire d'autres types de données. La plupart d'entre elles nécessitent un équipement supplémentaire en plus d'un microscope composé de base.

• Lumière réfléchie ou éclairage incident (pour l'analyse des structures de surface)
• Microscopie à fluorescence, à la fois :

• Microscopie à épifluorescence
• Microscopie confocale

• Microspectroscopie (où un spectrophotomètre UV-visible est intégré à un microscope optique)
• Microscopie ultraviolette
• Microscopie proche infrarouge
• Microscopie à transmission multiple pour l'amélioration du contraste et la réduction des aberrations.
• Automatisation (pour la numérisation automatique d'un grand échantillon ou la capture d'image)

La microscopie optique est largement utilisée en microélectronique, nanophysique, biotechnologie, recherche pharmaceutique, minéralogie et microbiologie.

La microscopie optique est utilisée pour le diagnostic médical , le domaine étant appelé histopathologie lorsqu'il s'agit de tissus, ou dans les tests de frottis sur des cellules libres ou des fragments de tissus.

Dans l'industrie, les microscopes binoculaires sont courants. Outre les applications nécessitant une véritable perception de la profondeur , l'utilisation d'oculaires doubles réduit la fatigue oculaire associée aux longues journées de travail au poste de microscopie. Dans certaines applications, les microscopes à longue distance de travail ou à longue focale sont bénéfiques. Un objet peut devoir être examiné derrière une fenêtre , ou des sujets industriels peuvent constituer un danger pour l'objectif. De telles optiques ressemblent à des télescopes avec des capacités de mise au point rapprochée.

Les microscopes de mesure sont utilisés pour les mesures de précision. Il existe deux types de base. L'un est doté d'un réticule gradué pour permettre de mesurer les distances dans le plan focal. un réticule simple et d'un mécanisme micrométrique pour déplacer le sujet par rapport au microscope.

Les microscopes très petits et portables ont trouvé une certaine utilité dans les endroits où un microscope de laboratoire serait un fardeau.

À des grossissements très élevés en lumière transmise, les objets ponctuels sont vus comme des disques flous entourés d' anneaux de diffraction . On les appelle disques d'Airy . Le pouvoir de résolution d'un microscope est considéré comme la capacité à distinguer deux disques d'Airy très proches (ou, en d'autres termes, la capacité du microscope à révéler des détails structurels adjacents comme distincts et séparés). Ce sont ces impacts de diffraction qui limitent la capacité à résoudre les détails fins. L'étendue et la magnitude des motifs de diffraction sont affectées à la fois par la longueur d'onde de la lumière (λ), les matériaux réfractifs utilisés pour fabriquer l'objectif et l' ouverture numérique (NA) de l'objectif. Il existe donc une limite finie au-delà de laquelle il est impossible de résoudre des points séparés dans le champ objectif, connue sous le nom de limite de diffraction . En supposant que les aberrations optiques dans l'ensemble du dispositif optique sont négligeables, la résolution d peut être énoncée comme suit :

En général, on suppose une longueur d'onde de 550 nm, ce qui correspond à la lumière verte . Avec l'air comme milieu externe, la valeur NA la plus élevée est de 0,95 et avec l'huile, jusqu'à 1,5. En pratique, la valeur la plus basse de d pouvant être obtenue avec des lentilles conventionnelles est d'environ 200 nm. Un nouveau type de lentille utilisant la diffusion multiple de la lumière a permis d'améliorer la résolution à moins de 100 nm.

Il existe plusieurs techniques permettant d'atteindre des résolutions supérieures à la limite de lumière transmise décrite ci-dessus. Les techniques holographiques, telles que décrites par Courjon et Bulabois en 1979, sont également capables de dépasser cette limite de résolution, bien que la résolution ait été limitée dans leur analyse expérimentale.

D'autres techniques sont disponibles à partir d'échantillons fluorescents. Parmi les exemples, citons la Vertico SMI , la microscopie optique à balayage en champ proche qui utilise des ondes évanescentes et la déplétion par émission stimulée . En 2005, un microscope capable de détecter une seule molécule a été décrit comme un outil pédagogique.

Malgré des progrès significatifs au cours de la dernière décennie, les techniques permettant de dépasser la limite de diffraction restent limitées et spécialisées.

Si la plupart des techniques se concentrent sur l'augmentation de la résolution latérale, certaines techniques visent également à permettre l'analyse d'échantillons extrêmement fins. Par exemple, les méthodes Sarfus placent l'échantillon fin sur une surface améliorant le contraste et permettent ainsi de visualiser directement des films aussi fins que 0,3 nanomètre.

Le 8 octobre 2014, le prix Nobel de chimie a été décerné à Eric Betzig , William Moerner et Stefan Hell pour le développement de la microscopie à fluorescence super-résolue .

La microscopie à illumination modulée spatialement (SMI) est un procédé optique de la technologie dite de la fonction d'étalement du point (PSF). Il s'agit de procédés qui modifient la PSF d'un microscope de manière appropriée pour augmenter la résolution optique, maximiser la précision des mesures de distance d'objets fluorescents qui sont petits par rapport à la longueur d'onde de la lumière d'éclairage ou extraire d'autres paramètres structurels dans la gamme nanométrique.

SPDM (spectral precision distance microscopy), la technologie de base de la microscopie de localisation, est un procédé optique léger de microscopie à fluorescence qui permet des mesures de position, de distance et d'angle sur des particules « optiquement isolées » (par exemple des molécules) bien en dessous de la limite théorique de résolution de la microscopie optique. « Optiquement isolée » signifie qu'à un moment donné, une seule particule/molécule dans une région d'une taille déterminée par la résolution optique conventionnelle (généralement environ 200-250 nm de diamètre ) est enregistrée. Cela est possible lorsque les molécules d'une telle région portent toutes des marqueurs spectraux différents (par exemple des couleurs différentes ou d'autres différences utilisables dans l' émission de lumière de différentes particules).

De nombreux colorants fluorescents standards comme les colorants GFP , Alexa, Atto, Cy2/Cy3 et les molécules de fluorescéine peuvent être utilisés pour la microscopie de localisation, à condition que certaines conditions photophysiques soient réunies. Grâce à cette technologie dite SPDMphymod (fluorophores physiquement modifiables), une seule longueur d'onde laser d'intensité appropriée suffit pour la nanoimagerie.

La microscopie 3D à super résolution avec des colorants fluorescents standard peut être obtenue en combinant la microscopie de localisation pour les colorants fluorescents standard SPDMphymod et l'éclairage structuré SMI.

L'émission stimulée est un exemple simple de la manière dont une résolution supérieure dépassant la limite de diffraction est possible, mais elle présente des limites majeures. STED est une technique de microscopie à fluorescence qui utilise une combinaison d'impulsions lumineuses pour induire la fluorescence dans une petite sous-population de molécules fluorescentes dans un échantillon. Chaque molécule produit un point lumineux limité par la diffraction dans l'image, et le centre de chacun de ces points correspond à l'emplacement de la molécule. Comme le nombre de molécules fluorescentes est faible, les points lumineux sont peu susceptibles de se chevaucher et peuvent donc être placés avec précision. Ce processus est ensuite répété plusieurs fois pour générer l'image. Stefan Hell de l'Institut Max Planck de chimie biophysique a reçu le 10e prix allemand du futur en 2006 et le prix Nobel de chimie en 2014 pour son développement du microscope STED et des méthodologies associées.

Afin de surmonter les limitations imposées par la limite de diffraction de la lumière visible, d'autres microscopes ont été conçus qui utilisent d'autres ondes.

• Microscope à force atomique (AFM)
• Microscope électronique à balayage (MEB)
• Microscopie à balayage à conductance ionique (SICM)
• Microscope à effet tunnel (STM)
• Microscopie électronique à transmission (MET)
• Microscope ultraviolet
• Microscope à rayons X

Il est important de noter que les ondes de fréquence plus élevée ont une interaction limitée avec la matière ; par exemple, les tissus mous sont relativement transparents aux rayons X, ce qui entraîne des sources de contraste distinctes et des applications cibles différentes.

L'utilisation d'électrons et de rayons X à la place de la lumière permet une résolution beaucoup plus élevée : la longueur d'onde du rayonnement est plus courte, donc la limite de diffraction est plus basse. Pour rendre la sonde à courte longueur d'onde non destructive, le système d'imagerie par faisceau atomique ( nanoscope atomique ) a été proposé et largement discuté dans la littérature, mais il n'est pas encore compétitif avec les systèmes d'imagerie conventionnels.

Les techniques STM et AFM sont des techniques de sonde à balayage qui utilisent une petite sonde qui est balayée sur la surface de l'échantillon. Dans ces cas, la résolution est limitée par la taille de la sonde ; les techniques de micro-usinage peuvent produire des sondes avec des rayons de pointe de 5 à 10 nm.

De plus, des méthodes telles que la microscopie électronique ou à rayons X utilisent un vide ou un vide partiel, ce qui limite leur utilisation pour les échantillons vivants et biologiques (à l'exception du microscope électronique à balayage environnemental ). Les chambres à échantillons nécessaires à tous ces instruments limitent également la taille des échantillons, et la manipulation des échantillons est plus difficile. La couleur n'est pas visible sur les images réalisées par ces méthodes, ce qui entraîne une perte d'informations. Elles sont cependant essentielles pour étudier les effets moléculaires ou atomiques, tels que le durcissement par vieillissement dans les alliages d'aluminium ou la microstructure des polymères .