Optical microscope

The optical microscope, also referred to as a light microscope, is a type of microscope that commonly uses visible light and a system of lenses to generate magnified images of small objects. Optical microscopes are the oldest type of microscope, with the present compound form first appearing in the 17th century. Basic optical microscopes can be very simple, although many complex designs aim to improve resolution and sample contrast.

Objects are placed on a stage and may be directly viewed through one or two eyepieces on the microscope. A range of objective lenses with different magnifications are usually mounted on a rotating turret between the stage and eyepiece(s), allowing magnification to be adjusted as needed. In high-power microscopes, both eyepieces typically show the same image, but with a stereo microscope, slightly different images are used to create a 3-D effect. A camera may be used to capture the magnified image (micrograph).

Objects can be lit in a variety of ways. Transparent objects can be lit from below and solid objects can be lit with light coming through (bright field) or around (dark field) the objective lens. Polarised light may be used to determine crystal orientation of metallic objects. Phase-contrast imaging can be used to increase image contrast by highlighting small details of differing refractive index.

The maximum resolving power of optical microscopes is typically limited to around 200 nanometers because of the diffraction limit of visible light. While larger magnifications are possible no additional details of the object are resolved. Alternatives to optical microscopy which do not use visible light include scanning electron microscopy, transmission electron microscopy and scanning probe microscopy, which can achieve much greater magnifications than optical microscopy.

Il existe deux types principaux de microscopes optiques : les microscopes simples et les microscopes composés. Un microscope simple utilise la puissance optique d'une seule lentille ou d'un groupe de lentilles pour grossir l'objet. Un microscope composé utilise un système de lentilles (chaque ensemble agrandissant l'image produite par un autre) pour obtenir un grossissement beaucoup plus important. La grande majorité des microscopes de recherche modernes sont des microscopes composés, tandis que certains microscopes numériques commerciaux plus abordables sont des microscopes simples à une seule lentille. Les microscopes composés se subdivisent en divers autres types, qui diffèrent par leur configuration optique, leur coût et leurs applications.image virtuelle agrandie et droite . L'utilisation d'une seule lentille convexe ou de groupes de lentilles se retrouve dans les dispositifs de grossissement simples tels que la loupe , les loupes et les oculaires pour télescopes et microscopes.

Un microscope composé utilise une lentille proche de l'objet observé pour collecter la lumière (appelée lentille d'objectif ), qui focalise une image réelle de l'objet à l'intérieur du microscope. Cette image est ensuite agrandie par une seconde lentille ou un groupe de lentilles (appelé oculaire ) qui donne à l'observateur une image virtuelle inversée et agrandie de l'objet.

L'utilisation d'un ensemble objectif-oculaire composé permet un grossissement angulaire bien supérieur : pour un objet de hauteur h , la mise au point est maximale à une taille angulaire non grossie , obtenue lorsqu'il est placé à la distance minimale de l'œil (environ 11 cm). L'image virtuelle ainsi créée atteint une taille angulaire de δ , où δ est la distance entre les foyers de l'objectif et de l'oculaire voisins. Cela correspond à un grossissement angulaire de δ .

Les microscopes composés courants sont souvent dotés d'objectifs interchangeables, permettant à l'utilisateur d'ajuster rapidement le grossissement. Un microscope composé permet également des configurations d'éclairage plus avancées, telles que le contraste de phase .Le microscope stéréoscopique est un microscope à faible grossissement qui offre une vue stéréoscopique de l'échantillon, couramment utilisé pour la dissection.

D'autres variantes de microscopes sont conçues pour différentes techniques d'éclairage :

• Le microscope pétrographique , dont la conception comprend généralement un filtre polarisant, une platine rotative et une plaque de gypse pour faciliter l'étude des minéraux ou autres matériaux cristallins dont les propriétés optiques peuvent varier selon l'orientation.
• Microscope polarisant , similaire au microscope pétrographique.
• Microscope à contraste de phase , qui utilise la méthode d'éclairage par contraste de phase.
• Microscope à épifluorescence , conçu pour l'analyse d'échantillons contenant des fluorophores.
• Le microscope confocal est une variante largement utilisée de l'éclairage épifluorescent qui utilise un laser de balayage pour illuminer un échantillon par fluorescence.
• Le microscope à deux photons est utilisé pour imager la fluorescence plus profondément dans les milieux diffusants et réduire le photoblanchiment, notamment dans les échantillons vivants.
• Microscope étudiant – un microscope souvent à faible grossissement avec des commandes simplifiées et parfois une optique de faible qualité conçu pour un usage scolaire ou comme instrument de départ pour les enfants.
• L'ultramicroscope est un microscope optique adapté qui utilise la diffusion de la lumière pour permettre l'observation de particules minuscules dont le diamètre est inférieur ou proche de la longueur d'onde de la lumière visible (environ 500 nanomètres) ; il est aujourd'hui largement obsolète depuis l'avènement des microscopes électroniques.
• Le microscope Raman à pointe améliorée est une variante du microscope optique basée sur la spectroscopie Raman à pointe améliorée , sans les limites de résolution traditionnelles basées sur la longueur d'onde. Ce microscope est principalement réalisé sur des plateformes de microscopes à sonde à balayage utilisant des outils entièrement optiques.

Bien que les technologies et les systèmes optiques de base des microscopes existent depuis plus de 400 ans, ce n'est que beaucoup plus récemment que les techniques d'éclairage des échantillons ont été développées pour générer les images de haute qualité que l'on voit aujourd'hui.August Köhler mit au point l'éclairage Köhler . Cette méthode d'éclairage d'échantillons permet d'obtenir un éclairage extrêmement uniforme et surmonte de nombreuses limitations des techniques d'éclairage plus anciennes. Avant l'invention de l'éclairage Köhler, l'image de la source lumineuse, par exemple le filament d'une ampoule , était toujours visible sur l'image de l'échantillon.prix Nobel de physique a été décerné au physicien néerlandais Frits Zernike en 1953 pour sa mise au point de l'éclairage par contraste de phase, permettant l'imagerie d'échantillons transparents. En utilisant l'interférence plutôt que l'absorption de la lumière, il est possible d'imager des échantillons extrêmement transparents, tels que des cellules de mammifères vivantes , sans recourir à des techniques de coloration. Deux ans plus tard seulement, en 1955, Georges Nomarski publiait la théorie de la microscopie à contraste interférentiel différentiel , une autre technique d'imagerie basée sur l'interférence .sondes fluorescentes pour des structures spécifiques au sein d'une cellule. Contrairement à la microscopie optique classique par transillumination, en microscopie de fluorescence, l'échantillon est éclairé à travers l'objectif par une gamme étroite de longueurs d'onde. Cette lumière interagit avec des fluorophores présents dans l'échantillon, qui émettent alors une lumière de longueur d' onde plus longue . C'est cette lumière émise qui forme l'image.le DAPI qui se lie à l'ADN , sont utilisés pour marquer des structures spécifiques au sein de la cellule. Parmi les développements plus récents, on peut citer l'immunofluorescence , qui utilise des anticorps marqués par fluorescence pour reconnaître des protéines spécifiques dans un échantillon, et les protéines fluorescentes comme la GFP, qu'une cellule vivante peut exprimer et qui la rend fluorescente.

Tous les microscopes optiques modernes conçus pour l'observation d'échantillons par transmission partagent les mêmes composants de base du trajet optique. De plus, la grande majorité des microscopes possèdent les mêmes composants « structurels » (numérotés ci-dessous selon l'image de droite) :

• Oculaire (lentille oculaire) (1)
• tourelle d'objectif, revolver ou porte-objectif rotatif (pour contenir plusieurs objectifs) (2)
• Lentilles objectives (3)
• Boutons de mise au point (pour déplacer la scène)
  • Réglage grossier (4)
  • Réglage fin (5)
• Platine (pour contenir l'échantillon) (6)
• source lumineuse (une lumière ou un miroir ) (7)
• Diaphragme et condenseur (8)
• Étape mécanique (9)

Oculaire (lentille oculaire)

oculaire est un cylindre contenant deux lentilles ou plus ; sa fonction est de permettre la mise au point de l'image pour l'œil. Il s'insère dans la partie supérieure du tube optique. Les oculaires sont interchangeables et offrent différents grossissements. Les grossissements typiques sont 5×, 10× (le plus courant), 15× et 20×. Sur certains microscopes haute performance, la configuration optique de l'objectif et de l'oculaire est optimisée pour obtenir les meilleures performances optiques possibles. C'est notamment le cas des objectifs apochromatiques .objectifs qui collectent la lumière provenant de l'échantillon. L'objectif est généralement logé dans un cylindre contenant une lentille composée en verre, mono- ou multi-élémentaire. On trouve généralement trois objectifs vissés sur un porte-objectifs circulaire rotatif permettant de sélectionner l'objectif souhaité. Ces montages sont conçus pour être parfocaux , ce qui signifie que lorsqu'on change d'objectif, l'échantillon reste net . Les objectifs de microscope sont caractérisés par deux paramètres : le grossissement et l'ouverture numérique . Le premier varie généralement de 5× à 100×, tandis que la seconde varie de 0,14 à 0,7, correspondant à des distances focales d'environ 40 à 2 mm, respectivement. Les objectifs à fort grossissement ont généralement une ouverture numérique plus élevée et une profondeur de champ plus faible . Certains objectifs haute performance peuvent nécessiter des oculaires adaptés pour offrir les meilleures performances optiques.objectifs à immersion (huile ou eau) pour une meilleure résolution à fort grossissement. Ces objectifs fonctionnent avec un matériau d'indice de réfraction adapté , comme de l'huile ou de l'eau, et une lamelle couvre-objet adaptée placée entre l'objectif et l'échantillon. L'indice de réfraction du matériau d'adaptation étant supérieur à celui de l'air, l'objectif possède une ouverture numérique plus importante (supérieure à 1), ce qui permet à la lumière de l'échantillon d'atteindre la face externe de l'objectif avec une réfraction minimale. Des ouvertures numériques allant jusqu'à 1,6 peuvent être obtenues . Cette ouverture numérique plus importante permet de collecter davantage de lumière, rendant possible l'observation détaillée de petits détails. Un objectif à immersion offre généralement un grossissement de 40 à 100×.les lames (plaques de verre rectangulaires de dimensions typiques 25 × 75 mm, sur lesquelles l'échantillon est monté).miroir . La plupart des microscopes, cependant, possèdent leur propre source lumineuse réglable et contrôlable – souvent une lampe halogène , bien que l'éclairage par LED et laser soit de plus en plus courant. L'éclairage Köhler est souvent proposé sur les instruments plus onéreux.condenseur est une lentille conçue pour focaliser la lumière de la source d'éclairage sur l'échantillon. Il peut également comporter d'autres éléments, tels qu'un diaphragme et/ou des filtres, afin de contrôler la qualité et l'intensité de l'éclairage. Pour les techniques d'éclairage comme la microscopie à fond noir , à contraste de phase et à contraste interférentiel différentiel, des composants optiques supplémentaires doivent être alignés avec précision sur le trajet optique.Le grossissement réel d'un microscope optique composé est le produit des grossissements de l' oculaire et de l'objectif. Par exemple, un oculaire de grossissement 10x et un objectif de grossissement 100x donnent un grossissement total de 1 000x. Des environnements modifiés, comme l'utilisation d'huile ou de lumière ultraviolette, peuvent améliorer la résolution et permettre l'observation de détails à des grossissements supérieurs à 1 000x.

Techniques d'éclairage

à contraste amélioré d'un échantillon. Parmi les principales techniques d'amélioration du contraste, on peut citer la lumière polarisée croisée , le fond noir , le contraste de phase et l'éclairage par contraste interférentiel différentiel . Une technique récente ( Sarfus ) combine la lumière polarisée croisée et des lames à contraste amélioré pour la visualisation d'échantillons nanométriques.papier tissu . 1,559 μm/pixel.

En éclairage à champ clair , le contraste de l'échantillon provient de l'absorption de la lumière par l'échantillon.

Éclairage par lumière polarisée croisée , le contraste de l'échantillon provient de la rotation de la lumière polarisée à travers l'échantillon.

En éclairage à fond noir , le contraste de l'échantillon provient de la lumière diffusée par celui-ci.

En éclairage à contraste de phase , le contraste de l'échantillon provient de l'interférence des différentes longueurs de trajet de la lumière à travers l'échantillon.

Autres techniques

Les microscopes modernes permettent bien plus que la simple observation d'une image en lumière transmise d'un échantillon ; de nombreuses techniques permettent d'extraire d'autres types de données. La plupart d'entre elles nécessitent un équipement supplémentaire en plus d'un microscope composé de base.Microscopie à épifluorescence

Microscopie confocale

• Microspectroscopie (où un spectrophotomètre UV-visible est intégré à un microscope optique)
• microscopie ultraviolette
• Microscopie proche infrarouge
• Microscopie à transmission multiple pour l'amélioration du contraste et la réduction des aberrations.
• Automatisation (pour la numérisation automatique d'un grand échantillon ou la capture d'images)

Applications

La microscopie optique est largement utilisée en microélectronique, en nanophysique, en biotechnologie, en recherche pharmaceutique, en minéralogie et en microbiologie.

La microscopie optique est utilisée pour le diagnostic médical , ce domaine étant appelé histopathologie lorsqu'il s'agit de tissus, ou lors de tests de frottis sur des cellules libres ou des fragments de tissus.une perception précise de la profondeur , l'utilisation de deux oculaires réduit la fatigue oculaire liée aux longues journées de travail à un poste de microscopie. Dans certaines applications, les microscopes à longue distance de travail ou à longue focale sont avantageux. Il peut être nécessaire d'examiner un objet derrière une vitre , ou certains produits industriels peuvent présenter un risque pour l'objectif. Ces systèmes optiques s'apparentent à des télescopes dotés d'une capacité de mise au point rapprochée.

Les microscopes de mesure sont utilisés pour des mesures de précision. Il en existe deux types principaux. Le premier est doté d'un réticule gradué permettant de mesurer les distances dans le plan focal. Le second type (plus ancien) possède un simple réticule en croix et un mécanisme micrométrique permettant de déplacer l'objet par rapport au microscope.

Les microscopes portables de très petite taille ont trouvé une certaine utilité dans des endroits où un microscope de laboratoire serait encombrant.

Limites

À très fort grossissement en lumière transmise, les objets ponctuels apparaissent comme des disques flous entourés d' anneaux de diffraction . On les appelle disques d'Airy . Le pouvoir de résolution d'un microscope est défini comme sa capacité à distinguer deux disques d'Airy très proches (autrement dit, sa capacité à révéler des détails structuraux adjacents comme distincts et séparés). Ce sont ces effets de diffraction qui limitent la résolution des détails fins. L'étendue et l'amplitude des figures de diffraction dépendent de la longueur d'onde de la lumière (λ), des matériaux réfractifs utilisés pour la fabrication de la lentille de l'objectif et de son ouverture numérique (ON). Il existe donc une limite finie au-delà de laquelle il est impossible de distinguer des points distincts dans le champ de l'objectif : la limite de diffraction . En supposant que les aberrations optiques de l'ensemble du système optique sont négligeables, la résolution d peut s'exprimer comme suit :

On considère généralement une longueur d'onde de 550 nm, correspondant à la lumière verte . Avec l'air comme milieu externe, l' ouverture numérique (NA) maximale pratique est de 0,95, et avec l'huile, jusqu'à 1,5. En pratique, la plus petite valeur de d pouvant être obtenue avec des lentilles conventionnelles est d'environ 200 nm. Un nouveau type de lentille utilisant la diffusion multiple de la lumière a permis d'améliorer la résolution à moins de 100 nm.

Dépassement de la limite de résolution

Plusieurs techniques permettent d’atteindre des résolutions supérieures à la limite de transmission de la lumière décrite précédemment. Les techniques holographiques, décrites par Courjon et Bulabois en 1979, permettent également de dépasser cette limite de résolution, bien que celle-ci ait été limitée dans leur analyse expérimentale.

L’utilisation d’échantillons fluorescents ouvre la voie à de nouvelles techniques. Citons par exemple la microscopie SMI de Vertico , la microscopie optique à champ proche utilisant les ondes évanescentes et la déplétion par émission stimulée . En 2005, un microscope capable de détecter une seule molécule a été décrit comme outil pédagogique.

Malgré des progrès significatifs au cours de la dernière décennie, les techniques permettant de dépasser la limite de diffraction restent limitées et spécialisées.Sarfus consiste à déposer l'échantillon mince sur une surface à contraste élevé, permettant ainsi la visualisation directe de films d'une épaisseur minimale de 0,3 nanomètre.prix Nobel de chimie a été décerné à Eric Betzig , William Moerner et Stefan Hell pour le développement de la microscopie de fluorescence à super-résolution .

Éclairage structuré SMI

La microscopie à illumination modulée spatialement (SMI) est un procédé optique optique basé sur l' ingénierie de la fonction d'étalement du point (PSF). Ce procédé consiste à modifier la PSF d'un microscope afin d'accroître la résolution optique, de maximiser la précision des mesures de distance d'objets fluorescents de petite taille par rapport à la longueur d'onde de la lumière d'illumination, ou d'extraire d'autres paramètres structuraux à l'échelle nanométrique.

Microscopie de localisation SPDMphymod

La microscopie de localisation spectrale de précision (SPDM), technique de base en microscopie de localisation, est un procédé optique de microscopie de fluorescence permettant de mesurer la position, la distance et l'angle de particules (par exemple, des molécules) « optiquement isolées », bien en deçà de la de diamètre ). Ceci est possible lorsque les molécules présentes dans cette région possèdent toutes des marqueurs spectraux différents (par exemple, des couleurs différentes ou d'autres différences exploitables dans l' émission de lumière des différentes particules).

De nombreux colorants fluorescents standard, tels que la GFP , les colorants Alexa, les colorants Atto, les molécules Cy2/Cy3 et la fluorescéine, peuvent être utilisés en microscopie de localisation, sous réserve de certaines conditions photophysiques. Grâce à cette technologie dite SPDMphymod (fluorophores physiquement modifiables), une seule longueur d'onde laser d'intensité appropriée suffit pour la nano-imagerie.

Microscopie à super résolution 3D

La microscopie à super résolution 3D avec des colorants fluorescents standard peut être réalisée par la combinaison de la microscopie de localisation pour les colorants fluorescents standard SPDMphymod et de l'illumination structurée SMI.

STED

La technique STED (Stimulated Emission Depletion) est un exemple simple de la possibilité d'atteindre une résolution supérieure à la limite de diffraction, mais elle présente des limitations importantes. La microscopie STED est une technique de microscopie à fluorescence qui utilise une combinaison d'impulsions lumineuses pour induire la fluorescence dans une petite sous-population de molécules fluorescentes d'un échantillon. Chaque molécule produit un point lumineux de taille limitée par la diffraction sur l'image, et le centre de chaque point correspond à la position de la molécule. Le nombre de molécules fluorescentes étant faible, les points lumineux ont peu de chances de se chevaucher et peuvent donc être positionnés avec précision. Ce processus est ensuite répété de nombreuses fois pour générer l'image. Stefan Hell, de l'Institut Max Planck de chimie biophysique, a reçu le 10e prix allemand de l'avenir en 2006 et le prix Nobel de chimie en 2014 pour ses travaux sur le microscope STED et les méthodologies associées.