Microscope

Un microscope (du grec ancien μικρός ( mikrós ) « petit » et σκοπέω ( skopéō ) « regarder, examiner, inspecter ») est un instrument de laboratoire utilisé pour examiner des objets trop petits pour être vus à l' œil nu . La microscopie est la science qui consiste à étudier de petits objets et structures à l'aide d'un microscope. Microscopique signifie être invisible à l'œil nu à moins d'être aidé par un microscope.

Il existe de nombreux types de microscopes, et ils peuvent être regroupés de différentes manières. L'une d'elles consiste à décrire la méthode utilisée par un instrument pour interagir avec un échantillon et produire des images, soit en envoyant un faisceau de lumière ou d'électrons à travers un échantillon sur son trajet optique , en détectant les émissions de photons d'un échantillon, soit en balayant à travers et sur une courte distance la surface d'un échantillon à l'aide d'une sonde. Le microscope le plus courant (et le premier à avoir été inventé) est le microscope optique , qui utilise des lentilles pour réfracter la lumière visible qui traverse un échantillon finement sectionné afin de produire une image observable. Les autres principaux types de microscopes sont le microscope à fluorescence , le microscope électronique (à la fois le microscope électronique à transmission et le microscope électronique à balayage ) et divers types de microscopes à sonde à balayage .

Bien que les objets ressemblant à des lentilles remontent à 4 000 ans et qu'il existe des récits grecs sur les propriétés optiques des sphères remplies d'eau (Ve siècle av. J.-C.) suivis de plusieurs siècles d'écrits sur l'optique, la première utilisation connue de microscopes simples ( loupes ) remonte à l'utilisation généralisée de lentilles dans les lunettes au XIIIe siècle. Les premiers exemples connus de microscopes composés, qui combinent une lentille objective près de l'échantillon avec un oculaire pour visualiser une image réelle , sont apparus en Europe vers 1620. L'inventeur est inconnu, même si de nombreuses revendications ont été faites au fil des ans. Plusieurs affirmations tournent autour des centres de fabrication de lunettes aux Pays-Bas , y compris les affirmations selon lesquelles il a été inventé en 1590 par Zacharias Janssen (revendication faite par son fils) ou le père de Zacharias, Hans Martens, ou les deux, affirme qu'il a été inventé par leur voisin et rival fabricant de lunettes, Hans Lippershey (qui a déposé le premier brevet de télescope en 1608), et affirme qu'il a été inventé par l'expatrié Cornelis Drebbel , qui aurait eu une version à Londres en 1619. Galilée (également parfois cité comme inventeur du microscope composé) semble avoir découvert après 1610 qu'il pouvait fermer la mise au point de son télescope pour voir de petits objets et, après avoir vu un microscope composé construit par Drebbel exposé à Rome en 1624, a construit sa propre version améliorée. Giovanni Faber a inventé le nom de microscope pour le microscope composé que Galilée a soumis à l' Accademia dei Lincei en 1625 (Galileo l'avait appelé l' occhiolino « petit œil »). René Descartes ( Dioptrique , 1637) décrit des microscopes dans lesquels un miroir concave, avec sa concavité vers l'objet, est utilisé, en conjonction avec une lentille, pour éclairer l'objet, qui est monté sur un point le fixant au foyer du miroir.

Le premier compte rendu détaillé de l' anatomie microscopique des tissus organiques basé sur l'utilisation d'un microscope n'apparaît qu'en 1644, dans L'œil de la mouche de Giambattista Odierna .

Le microscope était encore largement une nouveauté jusqu'aux années 1660 et 1670, lorsque les naturalistes d'Italie, des Pays-Bas et d'Angleterre commencèrent à l'utiliser pour étudier la biologie. Le scientifique italien Marcello Malpighi , appelé le père de l'histologie par certains historiens de la biologie, commença son analyse des structures biologiques avec les poumons. La publication en 1665 de Micrographia de Robert Hooke eut un énorme impact, en grande partie en raison de ses illustrations impressionnantes. Hooke créa de minuscules lentilles de petits globules de verre fabriqués en fusionnant les extrémités de fils de verre filé. Une contribution significative est venue d' Antonie van Leeuwenhoek qui a atteint un grossissement jusqu'à 300 fois en utilisant un simple microscope à lentille unique. Il a pris en sandwich une très petite lentille à bille de verre entre les trous de deux plaques métalliques rivetées ensemble, et avec une aiguille réglable par des vis fixée pour monter le spécimen. Van Leeuwenhoek a ensuite redécouvert les globules rouges (d'après Jan Swammerdam ) et les spermatozoïdes , et a contribué à populariser l'utilisation des microscopes pour observer l'ultrastructure biologique. Le 9 octobre 1676, van Leeuwenhoek a annoncé la découverte des micro-organismes.

Les performances d'un microscope optique composé dépendent de la qualité et de l'utilisation correcte du système de lentilles condensatrices pour focaliser la lumière sur l'échantillon et de la lentille d'objectif pour capturer la lumière de l'échantillon et former une image. Les premiers instruments étaient limités jusqu'à ce que ce principe soit pleinement compris et développé de la fin du 19e au tout début du 20e siècle, et jusqu'à ce que les lampes électriques soient disponibles comme sources de lumière. En 1893, August Köhler a développé un principe clé de l'éclairage de l'échantillon, l'éclairage de Köhler , qui est essentiel pour atteindre les limites théoriques de résolution du microscope optique. Cette méthode d'éclairage de l'échantillon produit un éclairage uniforme et surmonte le contraste et la résolution limités imposés par les premières techniques d'éclairage de l'échantillon. D'autres développements dans l'éclairage de l'échantillon sont venus de la découverte du contraste de phase par Frits Zernike en 1953 et de l'éclairage à contraste interférentiel différentiel par Georges Nomarski en 1955 ; tous deux permettent l'imagerie d'échantillons transparents non colorés.

Au début du XXe siècle, une alternative significative au microscope optique a été développée, un instrument qui utilise un faisceau d' électrons plutôt que de la lumière pour générer une image. Le physicien allemand Ernst Ruska , en collaboration avec l'ingénieur électricien Max Knoll , a développé le premier prototype de microscope électronique en 1931, un microscope électronique à transmission (MET). Le microscope électronique à transmission fonctionne sur des principes similaires à un microscope optique, mais utilise des électrons à la place de la lumière et des électroaimants à la place des lentilles en verre. L'utilisation d'électrons, au lieu de la lumière, permet une résolution beaucoup plus élevée.

Le développement du microscope électronique à transmission a été rapidement suivi en 1935 par le développement du microscope électronique à balayage par Max Knoll . Bien que les TEM aient été utilisés pour la recherche avant la Seconde Guerre mondiale et soient devenus populaires par la suite, le SEM n'était pas disponible dans le commerce avant 1965.

Les microscopes électroniques à transmission sont devenus populaires après la Seconde Guerre mondiale . Ernst Ruska, qui travaillait chez Siemens , a développé le premier microscope électronique à transmission commercial et, dans les années 1950, de grandes conférences scientifiques sur la microscopie électronique ont commencé à se tenir. En 1965, le premier microscope électronique à balayage commercial a été développé par le professeur Sir Charles Oatley et son étudiant de troisième cycle Gary Stewart, et commercialisé par la Cambridge Instrument Company sous le nom de « Stereoscan ».

L'une des dernières découvertes réalisées grâce à l'utilisation d'un microscope électronique est la capacité d'identifier un virus. Étant donné que ce microscope produit une image visible et claire de petits organites, il n'est pas nécessaire d'utiliser des réactifs pour voir le virus ou les cellules nocives dans un microscope électronique, ce qui permet de détecter plus efficacement les agents pathogènes.

De 1981 à 1983, Gerd Binnig et Heinrich Rohrer ont travaillé chez IBM à Zurich , en Suisse, pour étudier le phénomène de l'effet tunnel quantique . Ils ont créé un instrument pratique, un microscope à sonde à balayage issu de la théorie de l'effet tunnel quantique, qui lit les très petites forces échangées entre une sonde et la surface d'un échantillon. La sonde se rapproche de la surface si près que les électrons peuvent circuler en continu entre la sonde et l'échantillon, créant un courant de la surface à la sonde. Le microscope n'a pas été bien accueilli au départ en raison de la nature complexe des explications théoriques sous-jacentes. En 1984, Jerry Tersoff et DR Hamann, alors qu'ils travaillaient aux laboratoires Bell d'AT&T à Murray Hill, dans le New Jersey, ont commencé à publier des articles reliant la théorie aux résultats expérimentaux obtenus par l'instrument. Cela a été suivi de près en 1985 par des instruments commerciaux fonctionnels, et en 1986 par l'invention du microscope à force atomique par Gerd Binnig, Quate et Gerber , puis par le prix Nobel de physique de Binnig et Rohrer pour le SPM.

De nouveaux types de microscopes à sonde à balayage ont continué d'être développés à mesure que la capacité d'usiner des sondes et des pointes ultrafines a progressé.

Les développements les plus récents en microscopie optique se concentrent en grande partie sur l'essor de la microscopie à fluorescence en biologie . Au cours des dernières décennies du 20e siècle, en particulier à l'ère post- génomique , de nombreuses techniques de coloration fluorescente des structures cellulaires ont été développées. Les principaux groupes de techniques impliquent la coloration chimique ciblée de structures cellulaires particulières, par exemple, le composé chimique DAPI pour marquer l'ADN , l'utilisation d'anticorps conjugués à des rapporteurs fluorescents, voir immunofluorescence , et des protéines fluorescentes, telles que la protéine fluorescente verte . Ces techniques utilisent ces différents fluorophores pour l'analyse de la structure cellulaire au niveau moléculaire dans des échantillons vivants et fixés.

L'essor de la microscopie à fluorescence a conduit au développement d'un modèle de microscope moderne majeur, le microscope confocal . Le principe a été breveté en 1957 par Marvin Minsky , bien que la technologie laser ait limité l'application pratique de la technique. Ce n'est qu'en 1978 que Thomas et Christoph Cremer ont développé le premier microscope confocal à balayage laser pratique et la technique a rapidement gagné en popularité dans les années 1980.

La plupart des recherches actuelles (au début du 21e siècle) sur les techniques de microscopie optique se concentrent sur le développement d' analyses en super-résolution d'échantillons marqués par fluorescence. L'éclairage structuré peut améliorer la résolution d'environ deux à quatre fois et des techniques comme la microscopie à émission stimulée (STED) se rapprochent de la résolution des microscopes électroniques. Cela se produit parce que la limite de diffraction est obtenue à partir de la lumière ou de l'excitation, ce qui fait que la résolution doit être doublée pour devenir super-saturée. Stefan Hell a reçu le prix Nobel de chimie 2014 pour le développement de la technique STED, avec Eric Betzig et William Moerner qui ont adapté la microscopie à fluorescence pour la visualisation de molécules individuelles.

Les microscopes à rayons X sont des instruments qui utilisent le rayonnement électromagnétique, généralement dans la bande des rayons X mous, pour imager des objets. Les progrès technologiques dans l'optique des lentilles à rayons X au début des années 1970 ont fait de cet instrument un choix d'imagerie viable. Ils sont souvent utilisés en tomographie (voir tomographie par ordinateur ) pour produire des images tridimensionnelles d'objets, y compris des matières biologiques qui n'ont pas été fixées chimiquement. Des recherches sont actuellement menées pour améliorer l'optique des rayons X durs qui ont un plus grand pouvoir de pénétration.

Les microscopes peuvent être classés en plusieurs classes différentes. Le premier groupement est basé sur ce qui interagit avec l'échantillon pour générer l'image, c'est-à-dire la lumière ou les photons (microscopes optiques), les électrons (microscopes électroniques) ou une sonde (microscopes à sonde à balayage). Les microscopes peuvent également être classés selon qu'ils analysent l'échantillon via un point de balayage (microscopes optiques confocaux, microscopes électroniques à balayage et microscopes à sonde à balayage) ou analysent l'échantillon en une seule fois (microscopes optiques à grand champ et microscopes électroniques à transmission).

Les microscopes optiques à grand champ et les microscopes électroniques à transmission utilisent tous deux la théorie des lentilles ( optiques pour les microscopes optiques et lentilles électromagnétiques pour les microscopes électroniques) afin d'agrandir l'image générée par le passage d'une onde transmise à travers l'échantillon ou réfléchie par l'échantillon. Les ondes utilisées sont électromagnétiques (dans les microscopes optiques ) ou des faisceaux électroniques (dans les microscopes électroniques ). La résolution de ces microscopes est limitée par la longueur d'onde du rayonnement utilisé pour imager l'échantillon, alors que des longueurs d'onde plus courtes permettent une résolution plus élevée.

Les microscopes optiques et électroniques à balayage, comme le microscope confocal et le microscope électronique à balayage, utilisent des lentilles pour focaliser un point de lumière ou des électrons sur l'échantillon, puis analysent les signaux générés par le faisceau interagissant avec l'échantillon. Le point est ensuite balayé sur l'échantillon pour analyser une région rectangulaire. Le grossissement de l'image est obtenu en affichant les données issues du balayage d'une zone d'échantillon physiquement petite sur un écran relativement grand. Ces microscopes ont la même limite de résolution que les microscopes optiques, à sonde et électroniques à grand champ.

Les microscopes à sonde à balayage analysent également un seul point de l'échantillon, puis balayent la sonde sur une zone rectangulaire de l'échantillon pour créer une image. Comme ces microscopes n'utilisent pas de rayonnement électromagnétique ou électronique pour l'imagerie, ils ne sont pas soumis à la même limite de résolution que les microscopes optiques et électroniques décrits ci-dessus.

Le type de microscope le plus courant (et le premier inventé) est le microscope optique . Il s'agit d'un instrument optique contenant une ou plusieurs lentilles produisant une image agrandie d'un échantillon placé dans le plan focal. Les microscopes optiques ont un verre réfractif (parfois en plastique ou en quartz ), pour focaliser la lumière sur l'œil ou sur un autre détecteur de lumière. Les microscopes optiques à miroir fonctionnent de la même manière. Le grossissement typique d'un microscope optique, en supposant une lumière visible, est jusqu'à 1 250 × avec une limite de résolution théorique d'environ 0,250 micromètre ou 250 nanomètres . Cela limite le grossissement pratique à environ 1 500 ×. Des techniques spécialisées (par exemple, la microscopie confocale à balayage , Vertico SMI ) peuvent dépasser ce grossissement mais la résolution est limitée par la diffraction . L'utilisation de longueurs d'onde de lumière plus courtes, comme l'ultraviolet, est un moyen d'améliorer la résolution spatiale du microscope optique, tout comme des dispositifs tels que le microscope optique à balayage en champ proche .

Sarfus est une technique optique récente qui augmente la sensibilité d'un microscope optique standard jusqu'à un point où il est possible de visualiser directement des films nanométriques (jusqu'à 0,3 nanomètre) et des nano-objets isolés (jusqu'à 2 nm de diamètre). La technique est basée sur l'utilisation de substrats non réfléchissants pour la microscopie à lumière réfléchie polarisée croisée.

La lumière ultraviolette permet de distinguer des éléments microscopiques ainsi que d'obtenir des images d'échantillons transparents à l'œil nu. La lumière proche infrarouge peut être utilisée pour visualiser les circuits intégrés dans les dispositifs en silicium collé, car le silicium est transparent dans cette région de longueurs d'onde.

En microscopie à fluorescence, de nombreuses longueurs d'onde de lumière allant de l'ultraviolet au visible peuvent être utilisées pour provoquer la fluorescence des échantillons , ce qui permet une visualisation à l'œil nu ou avec des caméras particulièrement sensibles.

La microscopie à contraste de phase est une technique d'éclairage microscopique optique dans laquelle de petits décalages de phase dans la lumière traversant un échantillon transparent sont convertis en changements d'amplitude ou de contraste dans l'image. L'utilisation du contraste de phase ne nécessite pas de coloration pour visualiser la lame. Cette technique de microscope a permis d'étudier le cycle cellulaire dans des cellules vivantes.

Le microscope optique traditionnel a récemment évolué vers le microscope numérique . En plus ou au lieu de regarder directement l'objet à travers les oculaires , un type de capteur similaire à ceux utilisés dans un appareil photo numérique est utilisé pour obtenir une image, qui est ensuite affichée sur un écran d'ordinateur. Ces capteurs peuvent utiliser la technologie CMOS ou à dispositif à couplage de charge (CCD), selon l'application.

La microscopie numérique avec des niveaux de lumière très faibles pour éviter d'endommager les échantillons biologiques vulnérables est disponible en utilisant des caméras numériques sensibles à comptage de photons . Il a été démontré qu'une source lumineuse fournissant des paires de photons intriqués peut minimiser le risque d'endommager les échantillons les plus sensibles à la lumière. Dans cette application de l'imagerie fantôme à la microscopie à photons clairsemés, l'échantillon est éclairé par des photons infrarouges, dont chacun est spatialement corrélé à un partenaire intriqué dans la bande visible pour une imagerie efficace par une caméra à comptage de photons.

Les deux principaux types de microscopes électroniques sont les microscopes électroniques à transmission (MET) et les microscopes électroniques à balayage (MEB). Ils disposent tous deux d'une série de lentilles électromagnétiques et électrostatiques pour focaliser un faisceau d'électrons à haute énergie sur un échantillon. Dans un MET, les électrons traversent l'échantillon, de manière analogue à la microscopie optique de base . Cela nécessite une préparation minutieuse de l'échantillon, car les électrons sont fortement diffusés par la plupart des matériaux. Les échantillons doivent également être très fins (moins de 100 nm) pour que les électrons les traversent. Des coupes transversales de cellules colorées à l'osmium et aux métaux lourds révèlent des membranes organelles claires et des protéines telles que les ribosomes. Avec un niveau de résolution de 0,1 nm, des vues détaillées de virus (20 à 300 nm) et d'un brin d'ADN (2 nm de largeur) peuvent être obtenues. En revanche, le SEM possède des bobines matricielles pour balayer la surface des objets volumineux avec un faisceau d'électrons fin. Par conséquent, l'échantillon n'a pas nécessairement besoin d'être sectionné, mais un revêtement avec une couche nanométrique de métal ou de carbone peut être nécessaire pour les échantillons non conducteurs. Le SEM permet une imagerie rapide de la surface des échantillons, éventuellement dans une fine vapeur d'eau pour éviter le dessèchement.

Les différents types de microscopes à sonde à balayage proviennent des nombreux types d'interactions qui se produisent lorsqu'une petite sonde est balayée et interagit avec un échantillon. Ces interactions ou modes peuvent être enregistrés ou cartographiés en fonction de l'emplacement sur la surface pour former une carte de caractérisation. Les trois types de microscopes à sonde à balayage les plus courants sont les microscopes à force atomique (AFM), les microscopes optiques à balayage en champ proche (NSOM ou SNOM, microscopie optique à balayage en champ proche) et les microscopes à effet tunnel (STM). Un microscope à force atomique possède une sonde fine, généralement en silicium ou en nitrure de silicium, fixée à un cantilever ; la sonde est balayée sur la surface de l'échantillon et les forces qui provoquent une interaction entre la sonde et la surface de l'échantillon sont mesurées et cartographiées. Un microscope optique à balayage en champ proche est similaire à un AFM mais sa sonde est constituée d'une source lumineuse dans une fibre optique recouverte d'une pointe qui a généralement une ouverture pour le passage de la lumière. Le microscope peut capturer la lumière transmise ou réfléchie pour mesurer des propriétés optiques très localisées de la surface, généralement d'un échantillon biologique. Les microscopes à effet tunnel ont une pointe métallique avec un seul atome apical ; la pointe est fixée à un tube à travers lequel circule un courant. La pointe est balayée sur la surface d'un échantillon conducteur jusqu'à ce qu'un courant tunnel circule ; le courant est maintenu constant par le mouvement de la pointe par ordinateur et une image est formée par les mouvements enregistrés de la pointe.

Les microscopes acoustiques à balayage utilisent des ondes sonores pour mesurer les variations d'impédance acoustique. Similaires au sonar dans leur principe, ils sont utilisés pour des tâches telles que la détection de défauts dans les sous-surfaces des matériaux, y compris ceux trouvés dans les circuits intégrés. Le 4 février 2013, des ingénieurs australiens ont construit un « microscope quantique » qui offre une précision inégalée.

Les microscopes pour applications mobiles peuvent éventuellement être utilisés comme microscope optique lorsque la lampe de poche est activée. Cependant, les microscopes pour applications mobiles sont plus difficiles à utiliser en raison du bruit visuel , sont souvent limités à 40x et des limites de résolution de l'objectif de l' appareil photo lui-même.