Transcription inverse, réaction en chaîne par polymérase

La réaction en chaîne par polymérase avec transcription inverse ( RT-PCR ) est une technique de laboratoire combinant la transcription inverse de l'ARN en ADN (appelé dans ce contexte ADN complémentaire ou ADNc) et l'amplification de cibles ADN spécifiques à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Elle est principalement utilisée pour mesurer la quantité d'un ARN spécifique. Cela est réalisé en surveillant la réaction d'amplification à l'aide de la fluorescence, une technique appelée PCR en temps réel ou PCR quantitative (qPCR). Une confusion peut survenir car certains auteurs utilisent l'acronyme RT-PCR pour désigner la PCR en temps réel. Dans cet article, RT-PCR désignera la PCR par transcription inverse. La RT-PCR et la qPCR combinées sont couramment utilisées pour l'analyse de l'expression génétique et la quantification de l'ARN viral dans les milieux de recherche et cliniques.

L'association étroite entre RT-PCR et qPCR a conduit à l'utilisation métonymique du terme qPCR pour signifier RT-PCR. Une telle utilisation peut prêter à confusion, car la RT-PCR peut être utilisée sans qPCR, par exemple pour permettre le clonage moléculaire , le séquençage ou la simple détection d'ARN. Inversement, la qPCR peut être utilisée sans RT-PCR, par exemple pour quantifier le nombre de copies d'un fragment spécifique d'ADN.

La technique combinée RT-PCR et qPCR a été décrite comme RT-PCR quantitative ou RT-PCR en temps réel (parfois même appelée RT-PCR quantitative en temps réel ), et a été abrégée de diverses manières en qRT-PCR, RT-qPCR, RRT-PCR, et rRT-PCR. Afin d'éviter toute confusion, les abréviations suivantes seront utilisées de manière cohérente dans cet article :

Tous les auteurs, notamment les plus anciens, n'utilisent pas cette convention et le lecteur doit être prudent lorsqu'il suit des liens. La RT-PCR a été utilisée pour indiquer à la fois la PCR en temps réel (qPCR) et la PCR de transcription inverse (RT-PCR).

Depuis son introduction en 1977, le Northern blot a été largement utilisé pour la quantification de l'ARN malgré ses défauts : (a) technique chronophage, (b) nécessite une grande quantité d'ARN pour la détection et (c) quantitativement inexact en raison de la faible abondance de la teneur en ARN. Cependant, depuis que la PCR a été inventée par Kary Mullis en 1983, la RT PCR a depuis remplacé le Northern blot comme méthode de choix pour la détection et la quantification de l'ARN.

La RT-PCR est devenue la technologie de référence pour la détection et/ou la comparaison des niveaux d'ARN pour plusieurs raisons : (a) elle ne nécessite pas de traitement post-PCR, (b) une large gamme (> 10 ⁷ fois) d'abondance d'ARN peut être mesurée, et (c) elle fournit un aperçu des données qualitatives et quantitatives. En raison de sa simplicité, de sa spécificité et de sa sensibilité, la RT-PCR est utilisée dans un large éventail d' applications, depuis des expériences aussi simples que la quantification des cellules de levure dans le vin jusqu'à des utilisations plus complexes comme outils de diagnostic pour la détection d'agents infectieux tels que le virus de la grippe aviaire et le SARS-CoV-2 .

Dans la RT-PCR, la matrice d'ARN est d'abord convertie en ADN complémentaire (ADNc) à l'aide d'une transcriptase inverse (RT). L'ADNc est ensuite utilisé comme matrice pour l'amplification exponentielle à l'aide de la PCR. L'utilisation de la RT-PCR pour la détection de transcrits d'ARN a révolutionné l'étude de l'expression génétique de plusieurs manières importantes :

• Il est théoriquement possible de détecter les transcriptions de pratiquement n’importe quel gène
• A permis l'amplification des échantillons et éliminé le besoin de matériel de départ abondant requis lors de l'utilisation de l'analyse par transfert Northern
• Tolérance à la dégradation de l'ARN à condition que l'ARN couvrant l'amorce soit intact

La quantification de l'ARNm par RT-PCR peut être réalisée en une ou deux étapes. La différence entre les deux approches réside dans le nombre de tubes utilisés lors de la réalisation de la procédure. La réaction en deux étapes nécessite que la réaction de transcriptase inverse et l'amplification PCR soient effectuées dans des tubes séparés. L'inconvénient de l'approche en deux étapes est la sensibilité à la contamination due à la manipulation plus fréquente des échantillons. D'autre part, l'ensemble de la réaction, de la synthèse de l'ADNc à l'amplification PCR, se déroule dans un seul tube dans l'approche en une étape. L'approche en une étape est censée minimiser la variation expérimentale en contenant toutes les réactions enzymatiques dans un seul environnement. Elle élimine les étapes de pipetage du produit d'ADNc, qui demandent beaucoup de travail et sont sujettes à la contamination, vers la réaction PCR. L'utilisation ultérieure d' ADN polymérases thermostables tolérantes aux inhibiteurs , d'amplificateurs de polymérase avec une condition de RT-PCR en une étape optimisée, prend en charge la transcription inverse de l'ARN à partir d'échantillons non purifiés ou bruts, tels que le sang total et le sérum . Cependant, les modèles d'ARN de départ sont sujets à la dégradation dans l'approche en une étape, et l'utilisation de cette approche n'est pas recommandée lorsque des analyses répétées à partir du même échantillon sont nécessaires. De plus, l'approche en une étape est considérée comme moins précise que l'approche en deux étapes. C'est également la méthode d'analyse préférée lors de l'utilisation de colorants de liaison à l'ADN tels que SYBR Green, car l'élimination des dimères d'amorce peut être obtenue par un simple changement de la température de fusion . Néanmoins, l'approche en une étape est une solution relativement pratique pour la détection rapide de l'ARN cible directement dans la biodétection.

La quantification des produits de RT-PCR peut être divisée en deux catégories : en point final et en temps réel. L'utilisation de la RT-PCR en point final est préférée pour mesurer les changements d'expression génétique dans un petit nombre d'échantillons, mais la RT-PCR en temps réel est devenue la méthode de référence pour valider les résultats quantitatifs obtenus à partir d'analyses de matrice ou de changements d'expression génétique à l'échelle mondiale.

Les approches de mesure de la RT-PCR en point final nécessitent la détection des niveaux d'expression génétique par l'utilisation de colorants fluorescents comme le bromure d'éthidium , P32 des produits PCR à l'aide d' un phosphorimager , ou par comptage par scintillation . La RT-PCR en point final est généralement réalisée à l'aide de trois méthodes différentes : relative, compétitive et comparative.

RT-PCR relative

Les quantifications relatives de la RT-PCR impliquent la co-amplification d'un contrôle interne simultanément avec le gène d'intérêt. Le contrôle interne est utilisé pour normaliser les échantillons. Une fois normalisé, une comparaison directe des abondances relatives des transcriptions sur plusieurs échantillons d'ARNm peut être effectuée. Une précaution à prendre est que le contrôle interne doit être choisi de manière à ce qu'il ne soit pas affecté par le traitement expérimental. Le niveau d'expression doit être constant sur tous les échantillons et avec l'ARNm d'intérêt pour que les résultats soient précis et significatifs. Étant donné que la quantification des résultats est analysée en comparant la plage linéaire de l'amplification cible et de contrôle, il est essentiel de prendre en compte la concentration initiale des molécules cibles et leur taux d'amplification avant de commencer l'analyse. Les résultats de l'analyse sont exprimés sous forme de ratios entre le signal du gène et le signal du contrôle interne, dont les valeurs peuvent ensuite être utilisées pour la comparaison entre les échantillons dans l'estimation de l'expression relative de l'ARN cible.

RT-PCR compétitive

La technique de RT-PCR compétitive est utilisée pour la quantification absolue. Elle implique l'utilisation d'un ARN « concurrent » synthétique qui peut être distingué de l'ARN cible par une petite différence de taille ou de séquence. Il est important que la conception de l'ARN synthétique soit identique en séquence mais légèrement plus courte que l'ARN cible pour des résultats précis. Une fois conçu et synthétisé, une quantité connue de l'ARN concurrent est ajoutée aux échantillons expérimentaux et est co-amplifiée avec la cible par RT-PCR. Ensuite, une courbe de concentration de l'ARN concurrent est produite et elle est utilisée pour comparer les signaux de RT-PCR produits à partir des transcriptions endogènes afin de déterminer la quantité de cible présente dans l'échantillon.

RT-PCR comparative

La RT-PCR comparative est similaire à la RT-PCR compétitive dans la mesure où l'ARN cible entre en compétition pour les réactifs d'amplification au sein d'une seule réaction avec un étalon interne de séquence non apparentée. Une fois la réaction terminée, les résultats sont comparés à une courbe étalon externe pour déterminer la concentration d'ARN cible. Par rapport aux méthodes de quantification relative et compétitive, la RT-PCR comparative est considérée comme la méthode la plus pratique à utiliser car elle ne nécessite pas que l'investigateur effectue une expérience pilote ; dans la RT-PCR relative, la plage d'amplification exponentielle de l'ARNm doit être prédéterminée et dans la RT-PCR compétitive, un ARN compétiteur synthétique doit être synthétisé.

L'émergence de nouvelles techniques de marquage fluorescent de l'ADN au cours des dernières années a permis l'analyse et la détection de produits PCR en temps réel et a par conséquent conduit à l'adoption généralisée de la RT-PCR en temps réel pour l'analyse de l'expression génétique. La RT-PCR en temps réel est non seulement désormais la méthode de choix pour la quantification de l'expression génétique, mais elle est également la méthode préférée pour obtenir des résultats à partir d' analyses de matrice et d'expressions génétiques à l'échelle mondiale. Actuellement, quatre sondes d'ADN fluorescentes différentes sont disponibles pour la détection RT-PCR en temps réel de produits PCR : SYBR Green , TaqMan , les balises moléculaires et les sondes scorpion. Toutes ces sondes permettent la détection de produits PCR en générant un signal fluorescent. Alors que le colorant SYBR Green émet son signal fluorescent simplement en se liant à l'ADN double brin en solution, la génération de fluorescence des sondes TaqMan, des balises moléculaires et des scorpions dépend du couplage par transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) de la molécule de colorant et d'un fragment d'extinction aux substrats oligonucléotidiques.

SYBR Vert

Lorsque le SYBR Green se lie à l'ADN double brin des produits PCR, il émet de la lumière lors de l'excitation. L'intensité de la fluorescence augmente à mesure que les produits PCR s'accumulent. Cette technique est facile à utiliser car la conception de sondes n'est pas nécessaire étant donné le manque de spécificité de sa liaison. Cependant, comme le colorant ne distingue pas l'ADN double brin des produits PCR et ceux des dimères d'amorce, la surestimation de la concentration cible est un problème courant. Lorsqu'une quantification précise est une nécessité absolue, un test supplémentaire pour la validation des résultats doit être effectué. Néanmoins, parmi les méthodes de détection de produits RT-PCR en temps réel, le SYBR Green est la plus économique et la plus simple à utiliser.

Sondes TaqMan

Les sondes TaqMan sont des oligonucléotides qui ont une sonde fluorescente attachée à l'extrémité 5' et un extincteur à l'extrémité 3'. Pendant l'amplification par PCR, ces sondes s'hybrident aux séquences cibles situées dans l' amplicon et comme la polymérase réplique le modèle avec TaqMan lié, elle clive également la sonde fluorescente en raison de l'activité de la polymérase 5'-nucléase. Étant donné que la proximité étroite entre la molécule d'extinction et la sonde fluorescente empêche normalement la fluorescence d'être détectée par FRET, le découplage entraîne une augmentation de l'intensité de la fluorescence proportionnelle au nombre de cycles de clivage de la sonde. Bien que les sondes TaqMan bien conçues produisent des résultats de RT-PCR précis en temps réel, leur synthèse est coûteuse et prend du temps lorsque des sondes distinctes doivent être fabriquées pour chaque cible d'ARNm analysée. De plus, ces sondes sont sensibles à la lumière et doivent être soigneusement congelées sous forme d'aliquotes pour éviter toute dégradation.

Sondes à balises moléculaires

Similaires aux sondes TaqMan, les balises moléculaires utilisent également la détection FRET avec des sondes fluorescentes fixées à l'extrémité 5' et un extincteur fixé à l'extrémité 3' d'un substrat oligonucléotidique. Cependant, alors que les sondes fluorescentes TaqMan sont clivées pendant l'amplification, les sondes à balises moléculaires restent intactes et se lient à nouveau à une nouvelle cible à chaque cycle de réaction. Lorsqu'elles sont libres en solution, la proximité de la sonde fluorescente et de la molécule extinctrice empêche la fluorescence par FRET. Cependant, lorsque les sondes à balises moléculaires s'hybrident à une cible, le colorant fluorescent et l'extincteur sont séparés, ce qui entraîne l'émission de lumière lors de l'excitation. Comme pour les sondes TaqMan, les balises moléculaires sont coûteuses à synthétiser et nécessitent des sondes distinctes pour chaque cible d'ARN.

Sondes Scorpion

Les sondes Scorpion, comme les balises moléculaires, ne seront pas fluorescentes actives dans un état non hybridé, encore une fois, en raison de la sonde fluorescente à l'extrémité 5' qui est éteinte par la fraction à l'extrémité 3' d'un oligonucléotide. Avec les Scorpions, cependant, l'extrémité 3' contient également une séquence complémentaire au produit d'extension de l'amorce à l'extrémité 5'. Lorsque l'extension Scorpion se lie à son complément sur l'amplicon, la structure Scorpion s'ouvre, empêche le FRET et permet de mesurer le signal fluorescent.

Sondes multiplexées

Les sondes TaqMan, les balises moléculaires et les scorpions permettent la mesure simultanée de produits PCR dans un seul tube. Cela est possible car chacun des différents colorants fluorescents peut être associé à un spectre d'émission spécifique. Non seulement l'utilisation de sondes multiplex permet d'économiser du temps et des efforts sans compromettre l'utilité du test, mais son application dans de vastes domaines de recherche tels que l'analyse de la délétion génétique, l'analyse des mutations et du polymorphisme, l'analyse quantitative et la détection d'ARN, en fait une technique inestimable pour les laboratoires de nombreuses disciplines.

Deux stratégies sont couramment employées pour quantifier les résultats obtenus par RT-PCR en temps réel ; la méthode de la courbe standard et la méthode du seuil comparatif.

L'amplification exponentielle par PCR (réaction en chaîne par polymérase) à transcription inverse est une technique très sensible qui permet de détecter un très faible nombre de copies de molécules d'ARN. La RT-PCR est largement utilisée dans le diagnostic des maladies génétiques et, de manière semi-quantitative, dans la détermination de l'abondance de différentes molécules d'ARN spécifiques dans une cellule ou un tissu comme mesure de l'expression génétique .

La RT-PCR est couramment utilisée dans les méthodes de recherche pour mesurer l'expression des gènes. Par exemple, Lin et al. ont utilisé la qRT-PCR pour mesurer l'expression des gènes Gal dans les cellules de levure. Tout d'abord, Lin et al. ont conçu une mutation d'une protéine soupçonnée de participer à la régulation des gènes Gal. On a émis l'hypothèse que cette mutation abolirait sélectivement l'expression de Gal. Pour confirmer cela, les niveaux d'expression des gènes des cellules de levure contenant cette mutation ont été analysés à l'aide de la qRT-PCR. Les chercheurs ont pu déterminer de manière concluante que la mutation de cette protéine régulatrice réduisait l'expression de Gal. par transfert Northern est utilisée pour étudier plus en détail l'expression des gènes de l'ARN.

La RT-PCR peut également être très utile pour l'insertion de gènes eucaryotes dans des procaryotes . Étant donné que la plupart des gènes eucaryotes contiennent des introns , qui sont présents dans le génome mais pas dans l'ARNm mature, l'ADNc généré à partir d'une réaction de RT-PCR est la séquence d'ADN exacte (sans tenir compte de la nature sujette aux erreurs des transcriptases inverses) qui serait directement traduite en protéine après transcription . Lorsque ces gènes sont exprimés dans des cellules procaryotes à des fins de production ou de purification de protéines, l'ARN produit directement à partir de la transcription n'a pas besoin de subir d'épissage car le transcrit ne contient que des exons . (Les procaryotes, tels que E. coli, ne disposent pas du mécanisme d'épissage de l'ARNm des eucaryotes).

La RT-PCR peut être utilisée pour diagnostiquer des maladies génétiques telles que le syndrome de Lesch-Nyhan . Cette maladie génétique est causée par un dysfonctionnement du gène HPRT1 , qui conduit cliniquement à des calculs urinaires mortels d'acide urique et à des symptômes similaires à la goutte . [6] L'analyse des niveaux d'expression d'ARNm de HPRT1 chez une mère enceinte et un fœtus révélera si la mère est porteuse et si le fœtus est susceptible de développer le syndrome de Lesch-Nyhan.

Les scientifiques travaillent sur des moyens d'utiliser la RT-PCR dans la détection du cancer pour aider à améliorer le pronostic et surveiller la réponse au traitement. Les cellules tumorales circulantes produisent des transcriptions d'ARNm uniques en fonction du type de cancer. L'objectif est de déterminer quelles transcriptions d'ARNm servent de meilleurs biomarqueurs pour un type de cellule cancéreuse particulier, puis d'analyser ses niveaux d'expression avec la RT-PCR.

La RT-PCR est couramment utilisée dans l'étude des génomes de virus dont les génomes sont composés d'ARN, tels que le virus de la grippe A , les rétrovirus comme le VIH et le SARS-CoV-2 .

Malgré ses avantages majeurs, la RT-PCR n'est pas sans inconvénients. La croissance exponentielle de l' ADN complémentaire transcrit en sens inverse (ADNc) au cours des multiples cycles de PCR produit une quantification du point final inexacte en raison de la difficulté à maintenir la linéarité. Afin de fournir une détection et une quantification précises du contenu en ARN dans un échantillon, la qRT-PCR a été développée en utilisant une modification basée sur la fluorescence pour surveiller les produits d'amplification au cours de chaque cycle de PCR. L'extrême sensibilité de la technique peut être une arme à double tranchant puisque même la plus légère contamination de l'ADN peut conduire à des résultats indésirables. Une méthode simple pour éliminer les résultats faussement positifs consiste à inclure des ancres, ou des étiquettes , dans la région 5' d'une amorce spécifique du gène. De plus, la planification et la conception des études de quantification peuvent être techniquement difficiles en raison de l'existence de nombreuses sources de variation, notamment la concentration du modèle et l'efficacité de l'amplification. L'ajout d'une quantité connue d'ARN dans un échantillon, l'ajout d'une série de dilutions d'ARN générant une courbe standard et l'ajout d'un échantillon sans copie de modèle (sans ADNc) peuvent être utilisés comme contrôles.

‹Le modèle Manuel est à l'étude pour fusion .›

La RT-PCR peut être réalisée selon le protocole RT-PCR en une étape ou selon le protocole RT-PCR en deux étapes.

La RT-PCR en une étape consiste à soumettre les cibles d'ARNm (jusqu'à 6 kb) à une transcription inverse suivie d'une amplification par PCR dans un seul tube à essai. L'utilisation d'ARN intact de haute qualité et d'une amorce spécifique à la séquence produira les meilleurs résultats.

Une fois qu'un kit de RT-PCR en une étape avec un mélange de transcriptase inverse, d'ADN polymérase Taq et d'une polymérase de relecture est sélectionné et que tous les matériaux et équipements nécessaires sont obtenus, un mélange réactionnel doit être préparé. Le mélange réactionnel comprend des dNTP, des amorces, de l'ARN modèle, des enzymes nécessaires et une solution tampon. Le mélange réactionnel est ajouté à un tube PCR pour chaque réaction, suivi de l'ARN modèle. Les tubes PCR sont ensuite placés dans un cycleur thermique pour commencer le cycle. Dans le premier cycle, la synthèse de l'ADNc se produit. Le deuxième cycle est la dénaturation initiale au cours de laquelle la transcriptase inverse est inactivée. Les 40 à 50 cycles restants sont l'amplification, qui comprend la dénaturation, le recuit et l'élongation. Une fois l'amplification terminée, les produits de RT-PCR peuvent être analysés par électrophorèse sur gel .

(Manuel d'applications PCR et Biotools)

La RT-PCR en deux étapes, comme son nom l'indique, se déroule en deux étapes. D'abord la transcription inverse, puis la PCR. Cette méthode est plus sensible que la méthode en une étape. Les kits sont également utiles pour la RT-PCR en deux étapes. Tout comme pour la PCR en une étape, utilisez uniquement de l'ARN intact et de haute qualité pour obtenir les meilleurs résultats. L'amorce pour la PCR en deux étapes n'a pas besoin d'être spécifique à la séquence.

Combinez d'abord l'ARN modèle, l'amorce, le mélange dNTP et l'eau exempte de nucléase dans un tube PCR. Ajoutez ensuite un inhibiteur de RNase et de la transcriptase inverse au tube PCR. Ensuite, placez le tube PCR dans un thermocycleur pendant un cycle au cours duquel se produisent l'hybridation, l'extension et l'inactivation de la transcriptase inverse. Enfin, passez directement à l'étape deux qui est la PCR, ou conservez le produit sur de la glace jusqu'à ce que la PCR puisse être effectuée.

Ajoutez le mélange maître contenant le tampon, le mélange dNTP, le MgCl2 _, la polymérase Taq et l'eau sans nucléase à chaque tube PCR. Ajoutez ensuite l'amorce nécessaire aux tubes. Ensuite, placez les tubes PCR dans un thermocycleur pendant 30 cycles du programme d'amplification. Cela comprend la dénaturation, le recuit et l'élongation. Les produits de la RT-PCR peuvent être analysés par électrophorèse sur gel.

L'analyse quantitative par RT-PCR est considérée comme la référence absolue pour mesurer le nombre de copies de cibles d'ADNc spécifiques dans un échantillon, mais elle est mal standardisée. Par conséquent, bien qu'il existe de nombreuses publications utilisant cette technique, beaucoup fournissent des détails expérimentaux inadéquats et utilisent une analyse de données inappropriée pour tirer des conclusions inappropriées. En raison de la variabilité inhérente à la qualité de toute donnée de PCR quantitative, non seulement les examinateurs ont du mal à évaluer ces manuscrits, mais les études deviennent également impossibles à reproduire. Reconnaissant la nécessité de normaliser la communication des conditions expérimentales, les directives MIQE ( Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments , prononcées mykee) ont été publiées par un consortium international de scientifiques universitaires. Les directives MIQE décrivent les informations minimales nécessaires à l'évaluation des expériences de PCR quantitatives qui devraient être requises pour la publication afin d'encourager une meilleure pratique expérimentale et de garantir la pertinence, l'exactitude, l'interprétation correcte et la répétabilité des données de PCR quantitatives.

Outre les directives de reporting, le MIQE souligne la nécessité de normaliser la nomenclature associée à la PCR quantitative pour éviter toute confusion ; par exemple, l'abréviation qPCR devrait être utilisée pour la PCR quantitative en temps réel , tandis que RT-qPCR devrait être utilisée pour la transcription inverse-qPCR, et les gènes utilisés pour la normalisation devraient être appelés gènes de référence plutôt que gènes domestiques . Il propose également que les termes dérivés du commerce comme les sondes TaqMan ne soient pas utilisés, mais plutôt appelés sondes d'hydrolyse . En outre, il est proposé que le cycle de quantification (Cq) soit utilisé pour décrire le cycle de PCR utilisé pour la quantification au lieu du cycle de seuil (Ct), du point de croisement (Cp) et du point de décollage (TOP), qui font référence à la même valeur mais ont été inventés par différents fabricants d' instruments en temps réel .

Les lignes directrices comprennent les éléments suivants : 1) conception expérimentale, 2) échantillon, 3) extraction d'acide nucléique, 4) transcription inverse, 5) informations sur la cible de la qPCR, 6) oligonucléotides, 7) protocole, 8) validation et 9) analyse des données. Les éléments spécifiques de chaque élément portent une étiquette E (essentiel) ou D (souhaitable). Ceux étiquetés E sont considérés comme critiques et indispensables tandis que ceux étiquetés D sont considérés comme périphériques mais importants pour les meilleures pratiques.

En 2023, les chercheurs ont développé un prototype fonctionnel d'un système de laboratoire sur puce RT-LAMP , qui a fourni des résultats pour les tests SARS-CoV-2 en trois minutes. La technologie intègre des canaux microfluidiques dans des circuits imprimés, ce qui peut permettre une production de masse à faible coût.