Réaction en chaîne par polymérase

La réaction en chaîne par polymérase ( PCR ) est une méthode largement utilisée pour fabriquer rapidement des millions, voire des milliards de copies d'un échantillon d'ADN spécifique, ce qui permet aux scientifiques d'amplifier un très petit échantillon d'ADN (ou une partie de celui-ci) suffisamment pour permettre une étude détaillée. La PCR a été inventée en 1983 par le biochimiste américain Kary Mullis de Cetus Corporation . Mullis et le biochimiste Michael Smith , qui avaient développé d'autres méthodes essentielles de manipulation de l'ADN, ont reçu conjointement le prix Nobel de chimie en 1993.

La PCR est fondamentale pour de nombreuses procédures utilisées dans les tests et la recherche génétiques , notamment l'analyse d' échantillons anciens d'ADN et l'identification d'agents infectieux. Grâce à la PCR, des copies de très petites quantités de séquences d'ADN sont amplifiées de manière exponentielle dans une série de cycles de changements de température. La PCR est désormais une technique courante et souvent indispensable utilisée dans la recherche en laboratoire médical pour une grande variété d'applications, notamment la recherche biomédicale et la science médico-légale .

La plupart des méthodes de PCR reposent sur le cyclage thermique . Le cyclage thermique expose les réactifs à des cycles répétés de chauffage et de refroidissement pour permettre différentes réactions dépendantes de la température, en particulier la fusion de l'ADN et la réplication de l'ADN induite par des enzymes . La PCR utilise deux réactifs principaux : les amorces (qui sont de courts fragments d'ADN monocaténaire appelés oligonucléotides qui sont une séquence complémentaire de la région d'ADN cible) et une ADN polymérase thermostable . Dans la première étape de la PCR, les deux brins de la double hélice d'ADN sont physiquement séparés à haute température dans un processus appelé dénaturation des acides nucléiques . Dans la deuxième étape, la température est abaissée et les amorces se lient aux séquences complémentaires de l'ADN. Les deux brins d'ADN deviennent alors des modèles pour l'ADN polymérase pour assembler enzymatiquement un nouveau brin d'ADN à partir de nucléotides libres , les éléments constitutifs de l'ADN. Au fur et à mesure que la PCR progresse, l'ADN généré est lui-même utilisé comme modèle pour la réplication, déclenchant une réaction en chaîne dans laquelle le modèle d'ADN d'origine est amplifié de manière exponentielle .

Presque toutes les applications PCR utilisent une ADN polymérase thermostable , telle que la Taq polymérase , une enzyme isolée à l'origine de la bactérie thermophile Thermus aquaticus . Si la polymérase utilisée était sensible à la chaleur, elle se dénaturerait sous les températures élevées de l'étape de dénaturation. Avant l'utilisation de la Taq polymérase, l'ADN polymérase devait être ajoutée manuellement à chaque cycle, ce qui était un processus fastidieux et coûteux.

Les applications de cette technique comprennent le clonage d'ADN pour le séquençage , le clonage et la manipulation de gènes, la mutagenèse génétique, la construction de phylogénies basées sur l'ADN ou l'analyse fonctionnelle des gènes , le diagnostic et la surveillance des troubles génétiques , l'amplification de l'ADN ancien, l'analyse des empreintes génétiques pour le profilage de l'ADN (par exemple, en sciences médico-légales et en tests de parenté ) et la détection d' agents pathogènes dans les tests d'acides nucléiques pour le diagnostic des maladies infectieuses .

La PCR amplifie une région spécifique d'un brin d'ADN (la cible d'ADN). La plupart des méthodes de PCR amplifient des fragments d'ADN d'une longueur comprise entre 0,1 et 10 kilopaires de bases (kbp), bien que certaines techniques permettent d'amplifier des fragments jusqu'à 40 kbp. La quantité de produit amplifié est déterminée par les substrats disponibles dans la réaction, ce qui devient limitant à mesure que la réaction progresse.

Une configuration PCR de base nécessite plusieurs composants et réactifs, notamment :

• un modèle d'ADN qui contient la région cible de l'ADN à amplifier
• une ADN polymérase ; une enzyme qui polymérise de nouveaux brins d'ADN ; la Taq polymérase résistante à la chaleur est particulièrement courante, car elle est plus susceptible de rester intacte pendant le processus de dénaturation de l'ADN à haute température
• deux amorces d'ADN complémentaires des extrémités 3' (trois amorces) de chacun des brins sens et antisens de la cible d' ADN (l'ADN polymérase ne peut se lier et s'allonger qu'à partir d'une région double brin d'ADN ; sans amorces, il n'y a pas de site d'initiation double brin auquel la polymérase peut se lier) ; des amorces spécifiques complémentaires de la région cible de l'ADN sont sélectionnées au préalable et sont souvent fabriquées sur mesure en laboratoire ou achetées auprès de fournisseurs biochimiques commerciaux
• les désoxynucléosides triphosphates , ou dNTP (parfois appelés « désoxynucléotides triphosphates » ; nucléotides contenant des groupes triphosphates), les éléments constitutifs à partir desquels l'ADN polymérase synthétise un nouveau brin d'ADN
• une solution tampon fournissant un environnement chimique approprié pour une activité et une stabilité optimales de l'ADN polymérase
• cations bivalents , généralement des ions magnésium (Mg) ou manganèse (Mn) ; Mg ²⁺ est le plus courant, mais Mn ²⁺ peut être utilisé pour la mutagenèse de l'ADN par PCR , car une concentration plus élevée en Mn ²⁺ augmente le taux d'erreur lors de la synthèse de l'ADN ; et cations monovalents , généralement des ions potassium (K)

La réaction est généralement réalisée dans un volume de 10 à 200 μL dans de petits tubes de réaction (volumes de 0,2 à 0,5 mL) dans un thermocycleur . Le thermocycleur chauffe et refroidit les tubes de réaction pour atteindre les températures requises à chaque étape de la réaction (voir ci-dessous). De nombreux thermocycleurs modernes utilisent un dispositif Peltier , qui permet à la fois de chauffer et de refroidir le bloc contenant les tubes PCR simplement en inversant le courant électrique de l'appareil. Les tubes de réaction à parois minces permettent une conductivité thermique favorable pour permettre un équilibre thermique rapide. La plupart des thermocycleurs ont des couvercles chauffants pour éviter la condensation au sommet du tube de réaction. Les thermocycleurs plus anciens dépourvus de couvercle chauffant nécessitent une couche d'huile sur le dessus du mélange réactionnel ou une boule de cire à l'intérieur du tube.

En règle générale, la PCR consiste en une série de 20 à 40 changements de température répétés, appelés cycles thermiques, chaque cycle étant généralement composé de deux ou trois paliers de température distincts (voir la figure ci-dessous). Le cycle est souvent précédé d'un seul palier de température à très haute température (> 90 °C (194 °F)), suivi d'un maintien à la fin pour l'extension du produit final ou un bref stockage. Les températures utilisées et la durée de leur application dans chaque cycle dépendent de divers paramètres, notamment de l'enzyme utilisée pour la synthèse de l'ADN, de la concentration d'ions bivalents et de dNTP dans la réaction et de la température de fusion ( T _m ) des amorces. Les étapes individuelles communes à la plupart des méthodes de PCR sont les suivantes :

• Initialisation : Cette étape n'est requise que pour les ADN polymérases qui nécessitent une activation thermique par PCR à démarrage à chaud . Elle consiste à chauffer la chambre de réaction à une température de 94–96 °C (201–205 °F), ou de 98 °C (208 °F) si des polymérases extrêmement thermostables sont utilisées, puis à la maintenir pendant 1 à 10 minutes.
• Dénaturation : cette étape est la première étape du cycle régulier et consiste à chauffer la chambre de réaction à 94–98 °C (201–208 °F) pendant 20 à 30 secondes. Cela provoque la fusion de l'ADN , ou dénaturation, du modèle d'ADN double brin en brisant les liaisons hydrogène entre les bases complémentaires, ce qui donne deux molécules d'ADN simple brin.
• Recuit : Dans l'étape suivante, la température de réaction est abaissée à 50–65 °C (122–149 °F) pendant 20 à 40 secondes, ce qui permet le recuit des amorces à chacun des modèles d'ADN monocaténaire. Deux amorces différentes sont généralement incluses dans le mélange réactionnel : une pour chacun des deux compléments monocaténaires contenant la région cible. Les amorces sont elles-mêmes des séquences monocaténaires, mais sont beaucoup plus courtes que la longueur de la région cible, ne complétant que de très courtes séquences à l'extrémité 3' de chaque brin.

Il est essentiel de déterminer une température appropriée pour l'étape de recuit, car l'efficacité et la spécificité sont fortement affectées par la température de recuit. Cette température doit être suffisamment basse pour permettre l' hybridation de l'amorce au brin, mais suffisamment élevée pour que l'hybridation soit spécifique, c'est-à-dire que l'amorce ne doit se lier qu'à une partie parfaitement complémentaire du brin, et nulle part ailleurs. Si la température est trop basse, l'amorce peut se lier imparfaitement. Si elle est trop élevée, l'amorce peut ne pas se lier du tout. Une température de recuit typique est d'environ 3 à 5 °C inférieure à la T _m des amorces utilisées. Des liaisons hydrogène stables entre les bases complémentaires ne se forment que lorsque la séquence de l'amorce correspond très étroitement à la séquence de la matrice. Au cours de cette étape, la polymérase se lie à l'hybride amorce-matrice et commence la formation de l'ADN.

• Extension/élongation : La température à cette étape dépend de l'ADN polymérase utilisée ; la température d'activité optimale pour l'ADN polymérase thermostable de la Taq polymérase est d'environ 75–80 °C (167–176 °F), bien qu'une température de 72 °C (162 °F) soit couramment utilisée avec cette enzyme. Dans cette étape, l'ADN polymérase synthétise un nouveau brin d'ADN complémentaire du brin d'ADN matrice en ajoutant des dNTP libres du mélange réactionnel qui sont complémentaires du modèle dans la direction 5'-vers-3' , en condensant le groupe 5'-phosphate des dNTP avec le groupe 3'-hydroxy à l'extrémité du brin d'ADN naissant (en cours d'allongement). Le temps précis requis pour l'élongation dépend à la fois de l'ADN polymérase utilisée et de la longueur de la région cible de l'ADN à amplifier. En règle générale, à leur température optimale, la plupart des ADN polymérases polymérisent mille bases par minute. Dans des conditions optimales (c'est-à-dire s'il n'y a pas de limitations dues à des substrats ou des réactifs limitants), à chaque étape d'extension/élongation, le nombre de séquences cibles d'ADN est doublé. À chaque cycle successif, les brins modèles d'origine ainsi que tous les brins nouvellement générés deviennent des brins modèles pour le prochain cycle d'élongation, conduisant à une amplification exponentielle (géométrique) de la région cible spécifique de l'ADN.

Les processus de dénaturation, de recuit et d'élongation constituent un seul cycle. Plusieurs cycles sont nécessaires pour amplifier la cible d'ADN à des millions de copies. La formule utilisée pour calculer le nombre de copies d'ADN formées après un nombre donné de cycles est 2 ⁿ , où n est le nombre de cycles. Ainsi, une réaction définie pour 30 cycles produit 2 ³⁰ , soit 1 073 741 824 copies de la région cible d'ADN double brin d'origine.

• Allongement final : cette étape unique est facultative, mais est réalisée à une température de 70 à 74 °C (158 à 165 °F) (la plage de température requise pour une activité optimale de la plupart des polymérases utilisées dans la PCR) pendant 5 à 15 minutes après le dernier cycle de PCR pour garantir que tout ADN simple brin restant est entièrement allongé.
• Maintien final : L’étape finale refroidit la chambre de réaction à 4–15 °C (39–59 °F) pendant une durée indéterminée et peut être utilisée pour le stockage à court terme des produits PCR.

Pour vérifier si la PCR a généré avec succès la région cible d'ADN attendue (parfois aussi appelée amplimère ou amplicon ), l'électrophorèse sur gel d'agarose peut être utilisée pour séparer la taille des produits de PCR. La taille des produits de PCR est déterminée par comparaison avec une échelle d'ADN , un marqueur de poids moléculaire qui contient des fragments d'ADN de tailles connues, qui se déplace sur le gel aux côtés des produits de PCR.

Comme pour d'autres réactions chimiques, la vitesse de réaction et l'efficacité de la PCR sont affectées par des facteurs limitatifs. Ainsi, l'ensemble du processus de PCR peut être divisé en trois étapes en fonction de l'avancement de la réaction :

• Amplification exponentielle : à chaque cycle, la quantité de produit est doublée (en supposant une efficacité de réaction de 100 %). Après 30 cycles, une seule copie d'ADN peut être augmentée jusqu'à 1 000 000 000 (un milliard) de copies. En un sens, la réplication d'un brin discret d'ADN est donc manipulée dans un tube dans des conditions contrôlées. La réaction est très sensible : seules de minuscules quantités d'ADN doivent être présentes.
• Stade de stabilisation : La réaction ralentit à mesure que l'ADN polymérase perd son activité et que la consommation de réactifs, tels que les dNTP et les amorces, les rend plus limités.
• Plateau : Plus aucun produit ne s'accumule du fait de l'épuisement des réactifs et de l'enzyme.

En pratique, la PCR peut échouer pour diverses raisons, telles que la sensibilité ou la contamination. La contamination par de l'ADN étranger peut conduire à des produits aberrants et est traitée par des protocoles et des procédures de laboratoire qui séparent les mélanges pré-PCR des contaminants ADN potentiels. Par exemple, si l'ADN d'une scène de crime est analysé, une seule molécule d'ADN du personnel du laboratoire pourrait être amplifiée et fausser l'enquête. Par conséquent, les zones de configuration de la PCR sont séparées de l'analyse ou de la purification d'autres produits de PCR, des ustensiles en plastique jetables sont utilisés et la surface de travail entre les configurations de réaction doit être soigneusement nettoyée.

La spécificité peut être ajustée par des conditions expérimentales de sorte qu'aucun produit parasite ne soit généré. Les techniques de conception d'amorces sont importantes pour améliorer le rendement des produits de PCR et pour éviter la formation de produits non spécifiques. L'utilisation de composants tampons alternatifs ou d'enzymes polymérases peut aider à l'amplification de régions d'ADN longues ou autrement problématiques. Par exemple, la polymérase Q5 serait environ 280 fois moins sujette aux erreurs que la polymérase Taq. Les paramètres de fonctionnement (par exemple, la température et la durée des cycles) ou l'ajout de réactifs, tels que le formamide , peuvent augmenter la spécificité et le rendement de la PCR. Des simulations informatiques des résultats théoriques de la PCR ( PCR électronique ) peuvent être effectuées pour aider à la conception des amorces.

La PCR permet d'isoler des fragments d'ADN à partir de l'ADN génomique par amplification sélective d'une région spécifique de l'ADN. Cette utilisation de la PCR permet d'améliorer de nombreuses méthodes, telles que la génération de sondes d'hybridation pour l'hybridation Southern ou Northern et le clonage d'ADN , qui nécessitent de plus grandes quantités d'ADN, représentant une région d'ADN spécifique. La PCR fournit à ces techniques de grandes quantités d'ADN pur, ce qui permet d'analyser des échantillons d'ADN même à partir de très petites quantités de matériel de départ.

D'autres applications de la PCR comprennent le séquençage de l'ADN pour déterminer des séquences inconnues amplifiées par PCR dans lesquelles l'une des amorces d'amplification peut être utilisée dans le séquençage de Sanger , l'isolement d'une séquence d'ADN pour accélérer les technologies d'ADN recombinant impliquant l'insertion d'une séquence d'ADN dans un plasmide , un phage ou un cosmide (selon la taille) ou le matériel génétique d'un autre organisme. Les colonies bactériennes (telles que E. coli ) peuvent être rapidement examinées par PCR pour les constructions de vecteurs d'ADN correctes . La PCR peut également être utilisée pour l'empreinte génétique ; une technique médico-légale utilisée pour identifier une personne ou un organisme en comparant des ADN expérimentaux par différentes méthodes basées sur la PCR.

Certaines méthodes d'empreintes génétiques par PCR ont un pouvoir discriminant élevé et peuvent être utilisées pour identifier les relations génétiques entre individus, comme parent-enfant ou entre frères et sœurs, et sont utilisées dans les tests de paternité (Fig. 4). Cette technique peut également être utilisée pour déterminer les relations évolutives entre organismes lorsque certaines horloges moléculaires sont utilisées (c'est-à-dire les gènes 16S rRNA et recA des micro-organismes).

Comme la PCR amplifie les régions d'ADN qu'elle cible, elle peut être utilisée pour analyser des quantités extrêmement petites d'échantillons. Cela est souvent essentiel pour les analyses médico-légales , lorsque seule une quantité infime d'ADN est disponible comme preuve. La PCR peut également être utilisée dans l'analyse d' ADN ancien datant de plusieurs dizaines de milliers d'années. Ces techniques basées sur la PCR ont été utilisées avec succès sur des animaux, comme un mammouth vieux de quarante mille ans , ainsi que sur l'ADN humain, dans des applications allant de l'analyse de momies égyptiennes à l'identification d'un tsar russe et du corps du roi anglais Richard III .

Les méthodes de PCR quantitative ou PCR en temps réel (qPCR, à ne pas confondre avec RT-PCR ) permettent d'estimer la quantité d'une séquence donnée présente dans un échantillon, une technique souvent appliquée pour déterminer quantitativement les niveaux d' expression génétique . La PCR quantitative est un outil établi pour la quantification de l'ADN qui mesure l'accumulation du produit ADN après chaque cycle d'amplification par PCR.

La qPCR permet de quantifier et de détecter une séquence d'ADN spécifique en temps réel, car elle mesure la concentration pendant le processus de synthèse. Il existe deux méthodes de détection et de quantification simultanées. La première méthode consiste à utiliser des colorants fluorescents qui sont retenus de manière non spécifique entre les doubles brins. La deuxième méthode implique des sondes qui codent pour des séquences spécifiques et sont marquées par fluorescence. La détection d'ADN à l'aide de ces méthodes ne peut être observée qu'après l'hybridation des sondes avec son ADN complémentaire (ADNc). Une combinaison intéressante de techniques est la PCR en temps réel et la transcription inverse. Cette technique sophistiquée, appelée RT-qPCR, permet de quantifier une petite quantité d'ARN. Grâce à cette technique combinée, l'ARNm est converti en ADNc, qui est ensuite quantifié à l'aide de la qPCR. Cette technique réduit la possibilité d'erreur au point final de la PCR, augmentant les chances de détection de gènes associés à des maladies génétiques telles que le cancer. Les laboratoires utilisent la RT-qPCR pour mesurer avec sensibilité la régulation des gènes. Les fondements mathématiques de la quantification fiable de la PCR et de la RT-qPCR facilitent la mise en œuvre de procédures d'ajustement précises des données expérimentales dans les applications de recherche, médicales, diagnostiques et de maladies infectieuses.

Les futurs parents peuvent être testés pour savoir s'ils sont porteurs génétiques ou leurs enfants peuvent être testés pour savoir s'ils sont réellement atteints d'une maladie . Des échantillons d'ADN pour les tests prénataux peuvent être obtenus par amniocentèse , par prélèvement de villosités choriales ou même par l'analyse de cellules fœtales rares circulant dans le sang de la mère. L'analyse PCR est également essentielle au diagnostic génétique préimplantatoire , où les cellules individuelles d'un embryon en développement sont testées pour détecter des mutations.

• La PCR peut également être utilisée dans le cadre d'un test sensible de typage tissulaire , essentiel à la transplantation d'organes . Depuis 2008, il existe même une proposition visant à remplacer les tests traditionnels basés sur les anticorps pour déterminer le groupe sanguin par des tests basés sur la PCR.
• De nombreuses formes de cancer impliquent des altérations des oncogènes . En utilisant des tests basés sur la PCR pour étudier ces mutations, les schémas thérapeutiques peuvent parfois être personnalisés individuellement pour un patient. La PCR permet le diagnostic précoce de maladies malignes telles que la leucémie et les lymphomes , qui est actuellement la plus développée dans la recherche sur le cancer et est déjà utilisée en routine. Les tests PCR peuvent être effectués directement sur des échantillons d'ADN génomique pour détecter les cellules malignes spécifiques de la translocation avec une sensibilité au moins 10 000 fois supérieure à celle des autres méthodes. La PCR est très utile dans le domaine médical car elle permet l'isolement et l'amplification des suppresseurs de tumeurs. La PCR quantitative, par exemple, peut être utilisée pour quantifier et analyser des cellules individuelles, ainsi que pour reconnaître les confirmations et combinaisons d'ADN, d'ARNm et de protéines.

La PCR permet un diagnostic rapide et très spécifique des maladies infectieuses, notamment celles causées par des bactéries ou des virus. La PCR permet également d'identifier des micro-organismes non cultivables ou à croissance lente tels que les mycobactéries , les bactéries anaérobies ou les virus à partir d'essais de culture tissulaire et de modèles animaux . La base des applications diagnostiques de la PCR en microbiologie est la détection d'agents infectieux et la distinction des souches non pathogènes des souches pathogènes en vertu de gènes spécifiques.

La caractérisation et la détection des organismes responsables de maladies infectieuses ont été révolutionnées par la PCR de la manière suivante :

• Le virus de l'immunodéficience humaine (ou VIH ) est une cible difficile à détecter et à éradiquer. Les premiers tests d'infection reposaient sur la présence d'anticorps dirigés contre le virus circulant dans le sang. Cependant, les anticorps n'apparaissent que plusieurs semaines après l'infection, les anticorps maternels masquent l'infection d'un nouveau-né et les agents thérapeutiques pour combattre l'infection n'affectent pas les anticorps. Des tests PCR ont été développés qui peuvent détecter un seul génome viral parmi l'ADN de plus de 50 000 cellules hôtes. Les infections peuvent être détectées plus tôt, le sang donné peut être examiné directement pour détecter le virus, les nouveau-nés peuvent être immédiatement testés pour l'infection et les effets des traitements antiviraux peuvent être quantifiés .
• Certains micro-organismes pathogènes, comme celui responsable de la tuberculose , sont difficiles à prélever chez les patients et leur croissance en laboratoire est lente. Les tests basés sur la PCR ont permis de détecter un petit nombre d'organismes pathogènes (vivants ou morts) dans des échantillons pratiques . Une analyse génétique détaillée peut également être utilisée pour détecter la résistance aux antibiotiques, ce qui permet une thérapie immédiate et efficace. Les effets de la thérapie peuvent également être évalués immédiatement.
• La propagation d'un organisme pathogène dans les populations d' animaux domestiques ou sauvages peut être surveillée par un test PCR. Dans de nombreux cas, l'apparition de nouveaux sous-types virulents peut être détectée et surveillée. Les sous-types d'un organisme responsables d' épidémies antérieures peuvent également être déterminés par analyse PCR.
• L'ADN viral peut être détecté par PCR. Les amorces utilisées doivent être spécifiques aux séquences ciblées dans l'ADN d'un virus, et la PCR peut être utilisée pour des analyses diagnostiques ou le séquençage de l'ADN du génome viral. La haute sensibilité de la PCR permet la détection du virus peu de temps après l'infection et même avant le début de la maladie. Une telle détection précoce peut donner aux médecins un délai d'avance significatif dans le traitement. La quantité de virus (« charge virale ») chez un patient peut également être quantifiée par des techniques de quantification de l'ADN basées sur la PCR (voir ci-dessous). Une variante de la PCR ( RT-PCR ) est utilisée pour détecter l'ARN viral plutôt que l'ADN : dans ce test, l'enzyme transcriptase inverse est utilisée pour générer une séquence d'ADN qui correspond à l'ARN viral ; cet ADN est ensuite amplifié selon la méthode PCR habituelle. La RT-PCR est largement utilisée pour détecter le génome viral du SARS-CoV-2.
• Des maladies telles que la coqueluche (ou toux coquelucheuse ) sont causées par la bactérie Bordetella pertussis . Cette bactérie est responsable d'une grave infection respiratoire aiguë qui affecte divers animaux et humains et a entraîné la mort de nombreux jeunes enfants. La toxine de la coqueluche est une exotoxine protéique qui se lie aux récepteurs cellulaires par deux dimères et réagit avec différents types de cellules tels que les lymphocytes T qui jouent un rôle dans l'immunité cellulaire. La PCR est un outil de test important qui peut détecter des séquences dans le gène de la toxine de la coqueluche. Comme la PCR a une sensibilité élevée pour la toxine et un délai d'exécution rapide, elle est très efficace pour diagnostiquer la coqueluche par rapport à la culture.

Le développement de protocoles d’empreintes génétiques (ou ADN ) basés sur la PCR a connu une large application en criminalistique :

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  Dans sa forme la plus discriminante, l'empreinte génétique permet de distinguer de manière unique une personne de l'ensemble de la population mondiale . De minuscules échantillons d'ADN peuvent être isolés d'une scène de crime et comparés à ceux des suspects ou à ceux d'une base de données ADN de preuves ou de condamnés antérieurs. Des versions plus simples de ces tests sont souvent utilisées pour écarter rapidement des suspects lors d'une enquête criminelle. Des preuves de crimes vieux de plusieurs décennies peuvent être testées, confirmant ou disculpant les personnes initialement condamnées.
• Le typage ADN médico-légal est un moyen efficace d'identifier ou d'exonérer des suspects criminels grâce à l'analyse des preuves découvertes sur une scène de crime. Le génome humain comporte de nombreuses régions répétitives qui peuvent être trouvées dans des séquences génétiques ou dans des régions non codantes du génome. Plus précisément, jusqu'à 40 % de l'ADN humain est répétitif. Il existe deux catégories distinctes pour ces régions répétitives non codantes dans le génome. La première catégorie est appelée répétitions en tandem à nombre variable (Variable Number Tandem Repeats, VNTR), qui sont longues de 10 à 100 paires de bases, et la deuxième catégorie est appelée répétitions en tandem courtes (STR), qui se composent de sections répétées de 2 à 10 paires de bases. La PCR est utilisée pour amplifier plusieurs VNTR et STR bien connus à l'aide d'amorces qui flanquent chacune des régions répétitives. La taille des fragments obtenus à partir de n'importe quel individu pour chacune des STR indiquera quels allèles sont présents. En analysant plusieurs STR pour un individu, on trouvera un ensemble d'allèles pour chaque personne qui est statistiquement susceptible d'être unique. Les chercheurs ont identifié la séquence complète du génome humain. Cette séquence est facilement accessible via le site Web du NCBI et est utilisée dans de nombreuses applications de la vie réelle. Par exemple, le FBI a compilé un ensemble de sites marqueurs d'ADN utilisés pour l'identification, et ceux-ci sont appelés la base de données ADN du Combined DNA Index System (CODIS). L'utilisation de cette base de données permet d'utiliser l'analyse statistique pour déterminer la probabilité qu'un échantillon d'ADN corresponde. La PCR est un outil d'analyse très puissant et important à utiliser pour le typage ADN médico-légal, car les chercheurs n'ont besoin que d'une très petite quantité d'ADN cible pour être utilisé pour l'analyse. Par exemple, un seul cheveu humain avec un follicule pileux attaché contient suffisamment d'ADN pour effectuer l'analyse. De même, quelques spermatozoïdes, des échantillons de peau sous les ongles ou une petite quantité de sang peuvent fournir suffisamment d'ADN pour une analyse concluante.
• Des formes moins discriminantes d' empreintes génétiques peuvent être utiles dans les tests de paternité ADN , où un individu est mis en correspondance avec ses proches parents. L'ADN de restes humains non identifiés peut être testé et comparé à celui de parents, frères et sœurs ou enfants potentiels. Des tests similaires peuvent être utilisés pour confirmer les parents biologiques d'un enfant adopté (ou kidnappé). Le véritable père biologique d'un nouveau-né peut également être confirmé (ou infirmé).
• Il a été démontré que la conception PCR AMGX/AMGY permettait non seulement d'amplifier les séquences d'ADN à partir d'une quantité très infime de génome. Cependant, elle peut également être utilisée pour déterminer le sexe en temps réel à partir d'échantillons osseux médico-légaux. Cela constitue un moyen puissant et efficace de déterminer le sexe dans les cas médico-légaux et les spécimens anciens.

La PCR a été appliquée à de nombreux domaines de recherche en génétique moléculaire :

• La PCR permet de produire rapidement de courts fragments d'ADN, même lorsque seule la séquence des deux amorces est connue. Cette capacité de la PCR améliore de nombreuses méthodes, telles que la génération de sondes d'hybridation pour l'hybridation Southern ou Northern blot . La PCR fournit à ces techniques de grandes quantités d'ADN pur, parfois sous forme de brin unique, ce qui permet d'effectuer des analyses même à partir de très petites quantités de matériel de départ.
• Le séquençage de l'ADN peut également être facilité par la PCR. Des segments d'ADN connus peuvent être facilement produits à partir d'un patient présentant une mutation génétique. Des modifications de la technique d'amplification peuvent extraire des segments d'un génome totalement inconnu ou générer un seul brin d'une zone d'intérêt.
• La PCR a de nombreuses applications dans le processus plus traditionnel de clonage de l'ADN . Elle permet d'extraire des segments destinés à être insérés dans un vecteur à partir d'un génome plus volumineux, qui peut n'être disponible qu'en petites quantités. En utilisant un seul ensemble d'« amorces vectorielles », elle peut également analyser ou extraire des fragments qui ont déjà été insérés dans des vecteurs. Certaines modifications du protocole de PCR peuvent générer des mutations (générales ou dirigées vers un site) d'un fragment inséré.
• Le marquage des sites de séquences est un procédé dans lequel la PCR est utilisée comme indicateur de la présence d'un segment particulier d'un génome dans un clone particulier. Le Projet Génome Humain a trouvé cette application essentielle pour cartographier les clones de cosmides qu'il séquençait et pour coordonner les résultats de différents laboratoires.
• Une application de la PCR est l' analyse phylogénétique de l'ADN provenant de sources anciennes , telles que celles trouvées dans les os récupérés de Néandertaliens , dans les tissus congelés de mammouths ou dans le cerveau de momies égyptiennes. Dans certains cas, l'ADN hautement dégradé provenant de ces sources peut être réassemblé au cours des premières étapes de l'amplification.
• Une application courante de la PCR est l'étude des schémas d' expression des gènes . Les tissus (ou même les cellules individuelles) peuvent être analysés à différents stades pour voir quels gènes sont devenus actifs ou lesquels ont été désactivés. Cette application peut également utiliser la PCR quantitative pour quantifier les niveaux réels d'expression
• La capacité de la PCR à amplifier simultanément plusieurs loci à partir de spermatozoïdes individuels a grandement amélioré la tâche plus traditionnelle de cartographie génétique en étudiant les croisements chromosomiques après la méiose . Des événements de croisement rares entre des loci très proches ont été directement observés en analysant des milliers de spermatozoïdes individuels. De même, des délétions, des insertions, des translocations ou des inversions inhabituelles peuvent être analysées, le tout sans avoir à attendre (ou à payer) les longs et laborieux processus de fécondation, d'embryogenèse, etc.
• Mutagenèse dirigée : la PCR peut être utilisée pour créer des gènes mutants avec des mutations choisies par les scientifiques à volonté. Ces mutations peuvent être choisies afin de comprendre comment les protéines accomplissent leurs fonctions et de modifier ou d'améliorer la fonction des protéines.

La PCR présente un certain nombre d'avantages. Elle est relativement simple à comprendre et à utiliser et produit des résultats rapidement. La technique est très sensible et permet de produire des millions, voire des milliards de copies d'un produit spécifique pour le séquençage, le clonage et l'analyse. La qRT-PCR partage les mêmes avantages que la PCR, avec en plus l'avantage de quantifier le produit synthétisé. Par conséquent, elle est utile pour analyser les altérations des niveaux d'expression génétique dans les tumeurs, les microbes ou d'autres états pathologiques.

La PCR est un outil de recherche très puissant et pratique. Le séquençage des étiologies inconnues de nombreuses maladies est en cours grâce à la PCR. Cette technique peut aider à identifier la séquence de virus jusqu'alors inconnus liés à ceux déjà connus et ainsi nous permettre de mieux comprendre la maladie elle-même. Si la procédure peut être encore simplifiée et si des systèmes de détection non radiométriques sensibles peuvent être développés, la PCR occupera une place de choix dans les laboratoires cliniques pour les années à venir.

L'une des principales limitations de la PCR est que des informations préalables sur la séquence cible sont nécessaires pour générer les amorces qui permettront son amplification sélective. Cela signifie que, généralement, les utilisateurs de la PCR doivent connaître la ou les séquences précises en amont de la région cible sur chacun des deux modèles monocaténaires afin de garantir que l'ADN polymérase se lie correctement aux hybrides amorce-modèle et génère ensuite toute la région cible lors de la synthèse de l'ADN.

Comme toutes les enzymes, les ADN polymérases sont également sujettes à des erreurs, ce qui entraîne à son tour des mutations dans les fragments de PCR générés.

Une autre limitation de la PCR est que même la plus petite quantité d'ADN contaminant peut être amplifiée, ce qui entraîne des résultats trompeurs ou ambigus. Pour minimiser le risque de contamination, les chercheurs doivent réserver des salles séparées pour la préparation des réactifs, la PCR et l'analyse du produit. Les réactifs doivent être distribués en aliquotes à usage unique . Des pipettes avec pistons jetables et embouts de pipette extra-longs doivent être systématiquement utilisées. Il est en outre recommandé de s'assurer que la configuration du laboratoire suit un flux de travail unidirectionnel. Aucun matériel ou réactif utilisé dans les salles de PCR et d'analyse ne doit jamais être introduit dans la salle de préparation de la PCR sans décontamination complète.

Les échantillons environnementaux contenant des acides humiques peuvent inhiber l'amplification par PCR et conduire à des résultats inexacts.

• PCR spécifique d'allèle ou système de mutation réfractaire à l'amplification (ARMS) : technique de diagnostic ou de clonage basée sur les variations d'un seul nucléotide (SNV à ne pas confondre avec les SNP ) (différences d'une seule base chez un patient). Toute mutation impliquant un changement d'une seule base peut être détectée par ce système. Il nécessite une connaissance préalable d'une séquence d'ADN, y compris les différences entre les allèles , et utilise des amorces dont les extrémités 3' englobent le SNV (tampon de paires de bases autour du SNV généralement incorporé). L'amplification par PCR dans des conditions rigoureuses est beaucoup moins efficace en présence d'une discordance entre la matrice et l'amorce, donc une amplification réussie avec une amorce spécifique au SNP signale la présence du SNP spécifique ou de petites délétions dans une séquence. Voir Génotypage SNP pour plus d'informations.
• Assemblage PCR ou assemblage par cyclage de polymérase (PCA) : synthèse artificielle de longues séquences d'ADN en effectuant une PCR sur un pool d'oligonucléotides longs avec de courts segments superposés. Les oligonucléotides alternent entre les directions sens et antisens, et les segments superposés déterminent l'ordre des fragments de PCR, produisant ainsi de manière sélective le produit final d'ADN long.
• PCR asymétrique : amplifie préférentiellement un brin d'ADN dans une matrice d'ADN double brin. Elle est utilisée dans le séquençage et le sondage d'hybridation où l'amplification d'un seul des deux brins complémentaires est nécessaire. La PCR est réalisée comme d'habitude, mais avec un grand excès d'amorce pour le brin ciblé pour l'amplification. En raison de l'amplification lente ( arithmétique ) plus tard dans la réaction après que l'amorce limitante a été utilisée, des cycles supplémentaires de PCR sont nécessaires. [ 49 Une modification récente de ce processus, connue sous le nom de Linear- After- The- Exponential-PCR (LATE-PCR), utilise une amorce limitante avec une température de fusion ( T m ) plus élevée que l' _amorce en excès pour maintenir l'efficacité de la réaction lorsque la concentration d'amorce limitante diminue au milieu de la réaction.
• PCR convective : une méthode pseudo-isotherme de réalisation de la PCR. Au lieu de chauffer et de refroidir à plusieurs reprises le mélange PCR, la solution est soumise à un gradient thermique. Le flux convectif résultant de l'instabilité thermique déplace automatiquement les réactifs PCR des régions chaudes et froides à plusieurs reprises, ce qui permet la PCR. Des paramètres tels que les conditions limites thermiques et la géométrie de l'enceinte PCR peuvent être optimisés pour produire une PCR robuste et rapide en exploitant l'émergence de champs de flux chaotiques. Une telle configuration de PCR à flux convectif réduit considérablement les besoins en énergie et le temps de fonctionnement de l'appareil.
• Dial-out PCR : une méthode hautement parallèle pour récupérer des molécules d'ADN précises pour la synthèse de gènes. Une bibliothèque complexe de molécules d'ADN est modifiée avec des balises flanquantes uniques avant un séquençage massivement parallèle. Les amorces dirigées par des balises permettent ensuite la récupération de molécules avec les séquences souhaitées par PCR.
• PCR numérique (dPCR) : utilisée pour mesurer la quantité d'une séquence d'ADN cible dans un échantillon d'ADN. L'échantillon d'ADN est fortement dilué de sorte qu'après avoir effectué plusieurs PCR en parallèle, certaines d'entre elles ne reçoivent pas une seule molécule de l'ADN cible. La concentration d'ADN cible est calculée à l'aide de la proportion de résultats négatifs. D'où le nom de « PCR numérique ».
• Amplification dépendante de l'hélicase : similaire à la PCR traditionnelle, mais utilise une température constante plutôt que des cycles de dénaturation et de recuit/extension. L'ADN hélicase , une enzyme qui déroule l'ADN, est utilisée à la place de la dénaturation thermique.
• PCR à démarrage à chaud : technique qui réduit l'amplification non spécifique pendant les étapes initiales de mise en place de la PCR. Elle peut être réalisée manuellement en chauffant les composants de la réaction à la température de dénaturation (par exemple, 95 °C) avant d'ajouter la polymérase. Des systèmes enzymatiques spécialisés ont été développés qui inhibent l'activité de la polymérase à température ambiante, soit par la liaison d'un anticorps , soit par la présence d'inhibiteurs liés de manière covalente qui ne se dissocient qu'après une étape d'activation à haute température. La PCR à démarrage à chaud/fin à froid est obtenue avec de nouvelles polymérases hybrides qui sont inactives à température ambiante et sont instantanément activées à la température d'élongation.
• La PCR in silico (PCR numérique, PCR virtuelle, PCR électronique, e-PCR) fait référence aux outils informatiques utilisés pour calculer les résultats théoriques de la réaction en chaîne par polymérase à l'aide d'un ensemble donné d' amorces ( sondes ) pour amplifierles séquences d'ADN à partir d'un génome ou d'un transcriptome séquencé . La PCR in silico a été proposée comme outil pédagogique pour la biologie moléculaire.
• PCR interséquence spécifique (ISSR) : une méthode PCR pour l'empreinte digitale de l'ADN qui amplifie les régions entre les répétitions de séquences simples pour produire une empreinte digitale unique des longueurs de fragments amplifiés.
• PCR inverse : est couramment utilisée pour identifier les séquences flanquantes autour des inserts génomiques . Elle implique une série de digestions d'ADN et d'auto-ligatures , ce qui donne des séquences connues à chaque extrémité de la séquence inconnue.
• PCR médiée par ligature : utilise de petits lieurs d'ADN ligaturés à l'ADN d'intérêt et plusieurs amorces s'hybridant aux lieurs d'ADN ; elle a été utilisée pour le séquençage de l'ADN , la marche du génome et l'empreinte de l'ADN .
• PCR spécifique de méthylation (MSP) : développée par Stephen Baylin et James G. Herman à la Johns Hopkins School of Medicine, et utilisée pour détecter la méthylation des îlots CpG dans l'ADN génomique. L'ADN est d'abord traité avec du bisulfite de sodium, qui convertit les bases cytosine non méthylées en uracile, qui est reconnu par les amorces PCR comme thymine. Deux PCR sont ensuite réalisées sur l'ADN modifié, en utilisant des jeux d'amorces identiques, sauf au niveau des îlots CpG dans les séquences d'amorces. À ces points, un jeu d'amorces reconnaît l'ADN avec des cytosines pour amplifier l'ADN méthylé, et un jeu reconnaît l'ADN avec de l'uracile ou de la thymine pour amplifier l'ADN non méthylé. La MSP utilisant qPCR peut également être réalisée pour obtenir des informations quantitatives plutôt que qualitatives sur la méthylation.
• PCR par mini-amorces : utilise une polymérase thermostable (S-Tbr) qui peut s'étendre à partir d'amorces courtes (« smalligos ») aussi courtes que 9 ou 10 nucléotides. Cette méthode permet le ciblage par PCR de régions de liaison d'amorces plus petites et est utilisée pour amplifier des séquences d'ADN conservées, telles que le gène d'ARNr 16S (ou 18S eucaryote).
• Amplification de sonde dépendante de la ligature multiplex ( MLPA ) : permet d'amplifier plusieurs cibles avec une seule paire d'amorces, évitant ainsi les limitations de résolution de la PCR multiplex (voir ci-dessous).
• PCR multiplex : consiste en plusieurs jeux d'amorces dans un seul mélange PCR pour produire des amplicons de différentes tailles spécifiques à différentes séquences d'ADN. En ciblant plusieurs gènes à la fois, des informations supplémentaires peuvent être obtenues à partir d'un seul test qui nécessiterait autrement plusieurs fois plus de réactifs et plus de temps. Les températures de recuit de chacun des jeux d'amorces doivent être optimisées pour fonctionner correctement dans une seule réaction et les tailles d'amplicons. Autrement dit, leur longueur de paire de bases doit être suffisamment différente pour former des bandes distinctes lorsqu'elles sont visualisées par électrophorèse sur gel .
• PCR assistée par nanoparticules (nanoPCR) : certaines nanoparticules (NP) peuvent améliorer l'efficacité de la PCR (appelée ainsi nanoPCR), et certaines peuvent même surpasser les activateurs de PCR d'origine. Il a été rapporté que les points quantiques (QD) peuvent améliorer la spécificité et l'efficacité de la PCR. Les nanotubes de carbone à paroi simple (SWCNT) et les nanotubes de carbone à parois multiples (MWCNT) sont efficaces pour améliorer l'amplification de la PCR longue. La nanopoudre de carbone (CNP) peut améliorer l'efficacité de la PCR répétée et de la PCR longue, tandis que les NP d'oxyde de zinc , de dioxyde de titane et d'Ag se sont avérés augmenter le rendement de la PCR. Des données antérieures ont indiqué que les NP non métalliques conservaient une fidélité d'amplification acceptable. Étant donné que de nombreuses NP sont capables d'améliorer l'efficacité de la PCR, il est clair qu'il existe probablement un grand potentiel d'amélioration de la technologie nanoPCR et de développement de produits.
• PCR imbriquée : augmente la spécificité de l'amplification de l'ADN en réduisant le bruit de fond dû à l'amplification non spécifique de l'ADN. Deux jeux d'amorces sont utilisés dans deux PCR successives. Dans la première réaction, une paire d'amorces est utilisée pour générer des produits d'ADN qui, outre la cible visée, peuvent encore être constitués de fragments d'ADN amplifiés de manière non spécifique. Le ou les produits sont ensuite utilisés dans une seconde PCR avec un jeu d'amorces dont les sites de liaison sont complètement ou partiellement différents et situés en 3' de chacune des amorces utilisées dans la première réaction. La PCR imbriquée est souvent plus efficace pour amplifier spécifiquement de longs fragments d'ADN que la PCR classique, mais elle nécessite une connaissance plus détaillée des séquences cibles.
• PCR par chevauchement-extension ou épissage par chevauchement-extension (SOEing) : une technique de génie génétique utilisée pour assembler deux ou plusieurs fragments d'ADN contenant des séquences complémentaires. Elle est utilisée pour joindre des morceaux d'ADN contenant des gènes, des séquences régulatrices ou des mutations ; la technique permet de créer des constructions d'ADN spécifiques et longues. Elle peut également introduire des délétions, des insertions ou des mutations ponctuelles dans une séquence d'ADN.
• PAN-AC : utilise des conditions isothermes pour l'amplification et peut être utilisé dans des cellules vivantes.
• PAN-PCR : une méthode informatique permettant de concevoir des tests de typage bactérien basés sur des données de séquence du génome entier.
• PCR quantitative (qPCR) : utilisée pour mesurer la quantité d'une séquence cible (généralement en temps réel). Elle mesure quantitativement les quantités initiales d'ADN, d'ADNc ou d'ARN. La PCR quantitative est couramment utilisée pour déterminer si une séquence d'ADN est présente dans un échantillon et le nombre de ses copies dans l'échantillon. La PCR quantitative a un très haut degré de précision. Les méthodes de PCR quantitative utilisent des colorants fluorescents, tels que Sybr Green, EvaGreen ou des sondes d'ADN contenant des fluorophores , telles que TaqMan , pour mesurer la quantité de produit amplifié en temps réel. Elle est également parfois abrégée en RT-PCR ( PCR en temps réel ), mais cette abréviation ne doit être utilisée que pour la PCR de transcription inverse . qPCR est la contraction appropriée de PCR quantitative (PCR en temps réel).
• PCR à complément inverse (RC-PCR) : permet d'ajouter des domaines fonctionnels ou des séquences de votre choix à chaque extrémité de l'amplicon généré dans une seule réaction en tube fermé. Cette méthode génère des amorces spécifiques à la cible au sein de la réaction par l'interaction d'amorces universelles (qui contiennent les séquences ou les domaines souhaités à ajouter) et de sondes RC.
• Reverse Transcription PCR ( RT-PCR ) : pour amplifier l'ADN à partir de l'ARN. La transcriptase inverse effectue la transcription inverse de l'ARN en ADNc , qui est ensuite amplifié par PCR. La RT-PCR est largement utilisée dans le profilage d'expression , pour déterminer l'expression d'un gène ou pour identifier la séquence d'un transcrit d'ARN, y compris les sites de début et de fin de transcription. Si la séquence d'ADN génomique d'un gène est connue, la RT-PCR peut être utilisée pour cartographier l'emplacement des exons et des introns dans le gène. L'extrémité 5' d'un gène (correspondant au site de début de transcription) est généralement identifiée par RACE-PCR ( Rapid Amplification of cDNA Ends ).
• PCR dépendante de la RNase H (rhPCR) : une modification de la PCR qui utilise des amorces avec un bloc d'extension 3' qui peut être éliminé par une enzyme thermostable RNase HII. Ce système réduit les dimères d'amorces et permet de réaliser des réactions multiplexées avec un nombre plus élevé d'amorces.
• PCR à amorce spécifique unique (SSP-PCR) : permet l'amplification de l'ADN double brin même lorsque les informations de séquence ne sont disponibles qu'à une extrémité. Cette méthode permet l'amplification de gènes pour lesquels seule une information de séquence partielle est disponible et permet un déplacement unidirectionnel du génome depuis des régions connues vers des régions inconnues du chromosome.
• PCR en phase solide : englobe plusieurs significations, notamment l'amplification de Polony (où les colonies de PCR sont dérivées dans une matrice de gel, par exemple), la PCR en pont (les amorces sont liées de manière covalente à une surface de support solide), la PCR en phase solide conventionnelle (où la PCR asymétrique est appliquée en présence d'un support solide portant une amorce avec une séquence correspondant à l'une des amorces aqueuses) et la PCR en phase solide améliorée (où la PCR en phase solide conventionnelle peut être améliorée en utilisant une Tm élevée et une amorce de support solide imbriquée avec l'application facultative d'une « étape » thermique pour favoriser l'amorçage du support solide).
• PCR suicide : généralement utilisée en paléogénétique ou dans d'autres études où éviter les faux positifs et garantir la spécificité du fragment amplifié est la priorité absolue. Elle a été décrite à l'origine dans une étude visant à vérifier la présence du microbe Yersinia pestis dans des échantillons dentaires obtenus à partir de tombes du XIVe siècle de personnes supposément tuées par la peste pendant l'épidémie médiévale de peste noire . La méthode prescrit l'utilisation de toute combinaison d'amorces une seule fois dans une PCR (d'où le terme « suicide »), qui n'aurait jamais dû être utilisée dans une réaction de PCR de contrôle positif, et les amorces doivent toujours cibler une région génomique jamais amplifiée auparavant en laboratoire à l'aide de cet ensemble d'amorces ou de tout autre ensemble d'amorces. Cela garantit qu'aucun ADN contaminant provenant de réactions de PCR précédentes n'est présent dans le laboratoire, ce qui pourrait autrement générer des faux positifs.
• PCR entrelacée asymétrique thermique (TAIL-PCR) : pour l'isolement d'une séquence inconnue flanquant une séquence connue. Au sein de la séquence connue, la TAIL-PCR utilise une paire imbriquée d'amorces avec des températures de recuit différentes ; une amorce dégénérée est utilisée pour amplifier dans l'autre sens à partir de la séquence inconnue.
• PCR Touchdown ( Step-down PCR ) : une variante de la PCR qui vise à réduire le bruit de fond non spécifique en abaissant progressivement la température de recuit au fur et à mesure de la progression du cycle de PCR. La température de recuit lors des cycles initiaux est généralement de quelques degrés (3 à 5 °C) au-dessus de la T _m des amorces utilisées, tandis qu'aux cycles ultérieurs, elle est de quelques degrés (3 à 5 °C) en dessous de la T _m de l'amorce . Les températures plus élevées donnent une plus grande spécificité pour la liaison de l'amorce, et les températures plus basses permettent une amplification plus efficace des produits spécifiques formés au cours des cycles initiaux.
• Universal Fast Walking : pour la marche génomique et l'empreinte génétique en utilisant une PCR « bilatérale » plus spécifique que les approches « unilatérales » conventionnelles (utilisant une seule amorce spécifique au gène et une seule amorce générale, ce qui peut conduire à un « bruit » artificiel) en vertu d'un mécanisme impliquant la formation d'une structure en lariat. Les dérivés simplifiés de l'UFW sont LaNe RAGE (PCR imbriquée dépendante du lariat pour une amplification rapide des extrémités de l'ADN génomique), 5'RACE LaNe et 3'RACE LaNe.

Les enzymes résistantes à la chaleur qui sont un élément clé de la réaction en chaîne par polymérase ont été découvertes dans les années 1960 en tant que produit d'une forme de vie microbienne qui vivait dans les eaux surchauffées de Mushroom Spring à Yellowstone .

Un article de 1971 dans le Journal of Molecular Biology par Kjell Kleppe et ses collègues du laboratoire de H. Gobind Khorana a décrit pour la première fois une méthode d'utilisation d'un test enzymatique pour répliquer un modèle d'ADN court avec des amorces in vitro . Cependant, cette manifestation précoce du principe de base de la PCR n'a pas reçu beaucoup d'attention à l'époque et l'invention de la réaction en chaîne par polymérase en 1983 est généralement attribuée à Kary Mullis .

Lorsque Mullis a développé la PCR en 1983, il travaillait à Emeryville , en Californie, pour Cetus Corporation , l'une des premières sociétés de biotechnologie , où il était responsable de la synthèse de courtes chaînes d'ADN. Mullis a écrit qu'il a eu l'idée de la PCR alors qu'il roulait le long de la Pacific Coast Highway une nuit dans sa voiture. Il réfléchissait à une nouvelle façon d'analyser les changements (mutations) dans l'ADN lorsqu'il s'est rendu compte qu'il avait inventé une méthode d'amplification de n'importe quelle région d'ADN par des cycles répétés de duplication pilotés par l'ADN polymérase. Dans Scientific American , Mullis a résumé la procédure : « En commençant par une seule molécule du matériel génétique ADN, la PCR peut générer 100 milliards de molécules similaires en un après-midi. La réaction est facile à exécuter. Elle ne nécessite pas plus qu'un tube à essai, quelques réactifs simples et une source de chaleur. » L'empreinte génétique a été utilisée pour la première fois pour les tests de paternité en 1988.

Mullis a attribué son utilisation du LSD à son développement de la PCR : « Aurais-je inventé la PCR si je n'avais pas pris de LSD ? J'en doute sérieusement. Je pourrais m'asseoir sur une molécule d'ADN et regarder les polymères passer. J'ai appris cela en partie grâce aux drogues psychédéliques. »

Mullis et le biochimiste Michael Smith , qui avaient développé d'autres méthodes essentielles de manipulation de l'ADN, ont reçu conjointement le prix Nobel de chimie en 1993, sept ans après que Mullis et ses collègues de Cetus aient mis en pratique sa proposition pour la première fois. L'article de Mullis de 1985 avec RK Saiki et HA Erlich, « Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia » — l'invention de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) — a été honoré par un prix Citation for Chemical Breakthrough de la Division of History of Chemistry de l'American Chemical Society en 2017.

Au cœur de la méthode PCR se trouve l'utilisation d'une ADN polymérase adaptée capable de résister aux températures élevées de >90 °C (194 °F) requises pour la séparation des deux brins d'ADN dans la double hélice d'ADN après chaque cycle de réplication . Les ADN polymérases initialement utilisées pour les expériences in vitro préfigurant la PCR n'étaient pas capables de résister à ces températures élevées. Les premières procédures de réplication de l'ADN étaient donc très inefficaces et chronophages, et nécessitaient de grandes quantités d'ADN polymérase et une manipulation continue tout au long du processus.

La découverte en 1976 de la Taq polymérase , une ADN polymérase purifiée à partir de la bactérie thermophile Thermus aquaticus qui vit naturellement dans des environnements chauds (50 à 80 °C tels que les sources chaudes), a ouvert la voie à des améliorations spectaculaires de la méthode PCR. L'ADN polymérase isolée de T. aquaticus est stable à haute température et reste active même après dénaturation de l'ADN, ce qui évite d'avoir à ajouter une nouvelle ADN polymérase après chaque cycle. Cela a permis de mettre au point un processus automatisé basé sur un thermocycleur pour l'amplification de l'ADN.

La technique PCR a été brevetée par Kary Mullis et cédée à Cetus Corporation , où Mullis travaillait lorsqu'il a inventé la technique en 1983. L' enzyme polymérase Taq était également couverte par des brevets. Plusieurs procès très médiatisés ont été intentés en lien avec cette technique, notamment un procès infructueux intenté par DuPont . La société pharmaceutique suisse Hoffmann-La Roche a acheté les droits sur les brevets en 1992. Le dernier des brevets commerciaux de PCR a expiré en 2017.

Une bataille juridique concernant les brevets de l' enzyme Taq polymérase est toujours en cours plusieurs juridictions du monde entre Roche et Promega . Les litiges juridiques se sont prolongés de la durée de vie des brevets originaux sur la PCR et la Taq polymérase, qui ont expiré le 28 mars 2005.